細胞3D打印技術(shù)及應用

周為，張誠，趙丹陽

（大連理工大學 機械工程學院，遼寧大連 116024）

生物3D打印是一種涉及增材制造、生物醫(yī)學、材料科學、電子信息等多個學科領(lǐng)域的新興生物制造技術(shù)，它的出現(xiàn)極大地推動了組織工程與再生醫(yī)學的發(fā)展。傳統(tǒng)的生物3D打印技術(shù)主要利用不含細胞的生物材料來制造醫(yī)學模型、金屬骨骼、生物陶瓷、組織工程支架等生物制品。而隨著進一步的發(fā)展，生物3D打印延伸出了新的分支細胞3D打印技術(shù)（3D Cell Printing）。細胞3D打印技術(shù)是在3D打印的基礎上，以活細胞為原料結(jié)合生物材料、生命體材料的拓展延伸，打印活體組織與器官的一種技術(shù)。這種技術(shù)以計算機三維模型為基礎，通過離散堆積的方法，將生物材料或細胞按仿生形態(tài)、生物體功能、細胞特定微環(huán)境等要求，用增材制造法打印出同時具有復雜結(jié)構(gòu)與功能的生物三維結(jié)構(gòu)、體外三維生物功能體等生物醫(yī)學產(chǎn)品，在骨骼、皮膚、血管、心臟、腎臟、肝臟等組織等再生與重建、藥物篩選等領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。本文主要從細胞3D打印技術(shù)的方式及特點、細胞3D打印的應用、細胞3D打印的發(fā)展前景幾個方面展開簡要綜述。

1 細胞3D打印技術(shù)的方式和特點

1.1 噴墨細胞打印技術(shù)

噴墨細胞打印技術(shù)是最早應用于打印細胞的技術(shù)，由傳統(tǒng)的噴墨打印技術(shù)發(fā)展而來，其原理是利用熱技術(shù)或聲波技術(shù)，促使液體通過受計算機控制的噴嘴產(chǎn)生液滴，按照預先設定好的三維結(jié)構(gòu)噴射液滴。目前，用于細胞打印的噴墨打印機主要采用熱噴墨或聲波噴墨技術(shù)。熱噴墨打印機通過電加熱打印頭來產(chǎn)生壓力脈沖而使液滴離開噴嘴，其優(yōu)點是打印速度快、成本低和廣泛可用性，但在打印過程中，細胞和生物材料需要承受高溫及較大的剪切應力，并且噴嘴易堵塞、液滴的噴射方向易發(fā)生偏差、液滴尺寸不均勻等；聲波噴墨打印機使用與超聲場相關(guān)的聲輻射力把液滴從氣液界面處噴射出，通過調(diào)節(jié)聲波參數(shù)來控制液滴的大小和噴射速率，其優(yōu)點是可以避免噴嘴的堵塞，能夠控制液滴的尺寸和噴射方向，并能避免細胞暴露于高溫和機械應力之下[1]，缺點是對于打印材料的粘度有著嚴格的限制。可見，噴墨細胞打印的局限性在于其打印的生物材料必須是液態(tài)的，只有在這種情況下才能形成液滴。

1.2 微擠壓細胞打印技術(shù)

微擠壓細胞打印技術(shù)是最常見的細胞3D打印技術(shù)，該技術(shù)利用機械控制將生物材料通過擠出頭擠出沉積在基底上。目前常用的材料擠出方法有氣動式和機械式（活塞或螺桿）兩大類。氣動式打印機的優(yōu)點是其驅(qū)動機構(gòu)組件簡易，缺點是其擠出力的大小受到系統(tǒng)氣壓的限制、并且容易造成材料控制的延遲；機械式打印機的優(yōu)點是其可以更好地實現(xiàn)空間控制，并且更適用于高粘度水凝膠的打印[2]，缺點是會產(chǎn)生較大的機械應力從而對打印的生物材料造成損傷。與其他兩種技術(shù)不同的是，通過微擠壓細胞打印技術(shù)將生物材料擠出后會形成連續(xù)的材料絲而不是小液滴，導致生物材料和細胞承受較大的壓力和剪切應力，降低了打印出細胞的存活率，限制了其在再生醫(yī)學組織領(lǐng)域方面的應用。

1.3 激光輔助細胞打印技術(shù)

激光輔助細胞打印技術(shù)是利用聚焦的激光脈沖在色帶吸收層上產(chǎn)生高壓氣泡，將含有細胞的材料推射到接收基底上，其優(yōu)點是完全避免了其他細胞打印技術(shù)中細胞或生物材料堵塞的問題，同時對細胞的損傷很小，對細胞活力和細胞功能的影響可以忽略不計[3]；缺點是打印效率較低，不適合高通量地在體外構(gòu)建組織或器官，并且成本十分高昂，極大地限制了其在臨床方面的應用。

2 細胞3D打印技術(shù)的應用

2.1 組織工程

2.1.1 肝臟組織打印

肝功能衰竭與多器官功能衰竭相關(guān)，是導致高發(fā)病率和死亡率的重要原因，因此肝臟組織工程一直受到廣泛的關(guān)注。Faulkner-Jones等[4]首次使用人類多能干細胞（hPSCs）進行肝組織的細胞打印，打印完成后人類多能干細胞經(jīng)過刺激分化成肝細胞，用于肝臟微器官工程，并且分析細胞3D打印過程對干細胞功能的影響。Bertassoni等[5]使用肝癌細胞（HepG2）、載有成纖維細胞的明膠-甲基丙烯酰胺水凝膠和瓊脂糖進行細胞打印，在打印過程中快速降溫使瓊脂糖迅速固化，接著利用UV光使水凝膠完全凝膠后去除瓊脂糖來產(chǎn)生可灌注的通道。由于肝組織對藥物毒性高度敏感，細胞3D打印的肝臟組織模型在藥物測試和高通量篩選方面具有巨大的應用潛力，此外，用于器官移植的肝組織細胞打印也是未來的重點研究方向。

2.1.2 心臟主動脈瓣膜打印

隨著人口老齡化加重，老年性瓣膜病以及冠心病、心肌梗死后引起的瓣膜病變也越來越常見，而目前人工心臟瓣膜置換或瓣膜成形等手術(shù)治療是心臟瓣膜病的根治方法。細胞3D打印的心臟主動脈瓣膜可以針對病患心臟特性進行私人訂制，提高精確性和穩(wěn)定性，同時可以降低病患身體的排異反應，顯著提高瓣膜替換手術(shù)的成功率。Duan等[6]利用載有豬主動脈平滑肌細胞（SMC）、小葉間質(zhì)細胞（VIC）的明膠-藻酸混合水凝膠進行細胞3D打印，隨后利用鈣離子化學交聯(lián)形成完整的主動脈瓣膜。通過細胞3D打印的主動脈瓣膜在動物體內(nèi)實驗中表現(xiàn)出良好的瓣膜功能及可兼容性，但是由此誘發(fā)的炎癥性反應及移植后鈣化等病理問題需要進一步的研究[7]。

2.1.3 骨組織打印

由于人體骨骼形態(tài)不規(guī)則，并且不同性別、年齡、地區(qū)的個體形態(tài)差異較為明顯，細胞3D打印技術(shù)可以根據(jù)不同人體骨骼的差異來定制化打印人工骨骼，其在醫(yī)學臨床應用中有著極其廣泛的需求[8]。Pati等[9]利用來源于人鼻下鼻甲組織中的間充質(zhì)基質(zhì)細胞來產(chǎn)生礦化細胞外基質(zhì)（ECM），提高了打印的聚己內(nèi)酯（PCL）支架的成骨潛能，經(jīng)過短暫的體外培養(yǎng)后將支架脫細胞化，與對照組相比，其表現(xiàn)出更強的骨誘導和骨傳導性。Kundu等[10]將載有軟骨細胞的水凝膠利用細胞3D打印技術(shù)打印到提前制備好的支撐性結(jié)構(gòu)上，植入人體內(nèi)后生成適合人體的軟骨組織。盡管在骨組織的細胞打印取得了很大的進展，但具有不同結(jié)構(gòu)，不同生物力學和生物學特性的骨組織細胞打印仍是一個巨大的挑戰(zhàn)，需要進一步的研究以實現(xiàn)具有區(qū)域分化的骨組織打印。

2.1.4 血管組織打印

由于血管組織在組織構(gòu)建體中遞送營養(yǎng)物和氧氣、去除代謝殘留物方面具有不可替代的作用，只有在其基礎上才能構(gòu)建出結(jié)構(gòu)更復雜、功能更強大的組織和器官，目前血管組織的細胞3D打印得到了廣泛的關(guān)注。Kolesky等[11]利用載有成纖維細胞的甲基丙烯酸酐化明膠，結(jié)合經(jīng)過人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）內(nèi)皮化的微直徑管道進行細胞3D打印，可以制備出多細胞生物構(gòu)建體，將交聯(lián)完畢后的構(gòu)建體迅速降溫至4 ℃以液化去除Pluronic F127，最終形成完整的開放血管通道組織。Norotte等[12]將平滑肌細胞和成纖維細胞的球狀體利用細胞3D打印技術(shù)植入支撐性瓊脂糖凝膠的適當位置中，經(jīng)過體外的適當處理、培養(yǎng)也形成了相應的血管組織。通常在傳統(tǒng)的生物3D打印中難以產(chǎn)生血管組織，但是通過細胞3D打印技術(shù)就可以很好地解決這一難題。

2.1.5 神經(jīng)組織打印

神經(jīng)系統(tǒng)的損傷是一種嚴重影響人們生活的疾病，帶來沉重的家庭以及社會負擔。利用細胞3D打印技術(shù)不僅可以增強組織工程構(gòu)建體的神經(jīng)支配功能，還能夠直接產(chǎn)生新的神經(jīng)組織，在治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的研究價值。Owens等[13]將分離的小鼠骨髓干細胞和施萬細胞分別澆注在微直徑管中后進行細胞3D打印，使用微擠壓細胞打印技術(shù)將其以離散的管狀形式擠出，被擠出的施萬細胞被小鼠骨髓干細胞包裹，最終形成致密的神經(jīng)導管。Pateman等[14]利用細胞3D打印技術(shù)進行基于PEG的神經(jīng)引導導管打印并用于神經(jīng)修復的研究，其打印神經(jīng)引導導管的分辨率與自體移植物對比，具有更好的分辨率。

2.1.6 皮膚組織打印

通過細胞3D打印技術(shù)構(gòu)建的組織工程皮膚不僅可以應用于燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷等造成的皮膚損傷修復、移植，還可以作為體外模型用于皮膚相關(guān)產(chǎn)品檢測及皮膚疾病機理研究等。Vivian等[15]使用角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞利用細胞3D打印技術(shù)分別打印表皮和真皮組織，使用膠原蛋白來替代皮膚的真皮基質(zhì)，優(yōu)化相關(guān)細胞打印參數(shù)來提高細胞存活率，同時確定合適的表皮和真皮細胞密度來模擬人體皮膚的生理相關(guān)環(huán)境。通過組織學和免疫熒光表征證明其利用細胞3D打印技術(shù)構(gòu)建的皮膚組織在形態(tài)學和生物學上與天然人體皮膚組織類似。Stefanie等[16]利用激光輔助細胞打印技術(shù)將成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞定位在穩(wěn)定基質(zhì)之上，經(jīng)過體外適當培養(yǎng)制備出完全細胞化的皮膚替代物。

2.2 細胞傳感器

細胞傳感器（Cell-based biosensors，CBBs）是利用活細胞作為分子識別敏感元件，感應環(huán)境中的毒性物質(zhì)及污染物的裝置。目前，以原核和真核細胞為主的細胞傳感器已成為一種快速檢測工具，其在環(huán)境監(jiān)測、藥品研發(fā)、食品工業(yè)等領(lǐng)域顯示出巨大潛力。

在基于微電極的細胞傳感器中，為準確地測定細胞的電位變化，需要使細胞固定在細胞傳感器中的微電極上，這就需要細胞具有良好的位置穩(wěn)定性。通過細胞3D打印技術(shù)不僅可以高通量地制備載有細胞的水凝膠、還可以在微米量級精確控制細胞的位置[17]。Hui等[18]將苦味受體細胞（味覺細胞STC-1和ICR小鼠味蕾細胞）作為感應原件培養(yǎng)在絲網(wǎng)印刷玻碳電極表面，利用阻抗圖譜信號研究促味劑對它的應激反應作用。pH傳感器廣泛應用于以pH值為參照數(shù)的工業(yè)、電力、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、科研和環(huán)保領(lǐng)域，通過細胞3D打印技術(shù)提高其靈敏度具有極大的研究意義。Bashir等[19]設計的細胞傳感器對pH值變化極其靈敏，通過原子力顯微鏡進行偏轉(zhuǎn)測量來測定pH值的變化，其可以測定出最低5×10-5pH的酸堿值變化。

2.3 藥物代謝動力學和藥物篩選

目前，主要采用體外（in vitro）、體內(nèi)（in vivo）及計算機模擬的方法，對先導物的藥物代謝和藥物動力學特征進行早期高通量快速評價。由于人體組織器官的復雜性，很難通過計算機模擬出準確的藥物代謝過程，通常需要和體外模型結(jié)合起來對藥物進行早期的篩選和評價。在藥物實驗室中，通常使用動物體模型來對藥物進行篩選和檢測，但是由于動物體的組織器官和人體存在一定的差異性，僅根據(jù)動物體的實驗結(jié)果不足以評價藥物對人體的影響，而且很多病原體對器官的影響具有個異性如丙型肝炎。為了更加準確、實時地表達出藥物對人體的影響，在藥物研發(fā)中構(gòu)建基于人體細胞的體外模型是十分有必要的，不僅可以準確地反映出人體對藥物的整個反應過程，還可以降低藥物研發(fā)過程的成本。

細胞3D打印技術(shù)可以將細胞均勻地沉積在微型器件的表面上，這種均勻性非常適用于測試和篩選細胞和藥物之間的相互作用。Orive等[20]設計了一種仿生細胞-水凝膠膠囊，可以促進封閉環(huán)境內(nèi)細胞的長期功能表達、提高受控藥物傳遞膠囊的機械穩(wěn)定性、治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病等各種病理問題。Chang等[21]開發(fā)了一種氣動式細胞打印機，利用載有肝細胞的水凝膠對肝臟藥物測試平臺進行原型設計，該平臺可以表達出不同的藥物代謝水平。細胞3D打印技術(shù)還可用于在微器件界面的每一側(cè)均勻地接種細胞層來形成器官芯片，器官芯片可以模擬出器官的局部代謝功能，有助于研究藥物之間的相互作用及其對組織器官的潛在影響。

2.4 腫瘤研究

目前，二維腫瘤模型廣泛應用于癌癥研究中，但是由于缺乏細胞之間的立體相互作用，不能代表腫瘤生存的真實生理環(huán)境，從而無法準確、實時地反映出腫瘤對人體組織器官的具體影響。由于細胞3D打印技術(shù)可以準確定位各種細胞類型從而模擬出近似人體生理環(huán)境的癌癥微環(huán)境，可以為研究癌癥發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制提供極大的助力，細胞3D打印技術(shù)對于腫瘤領(lǐng)域方面的醫(yī)學研究有著巨大的研究潛力。Demirci等[22]利用細胞3D打印技術(shù)首次打印出體外腫瘤組織模型，使用雙噴頭噴墨細胞打印機對人卵巢癌細胞（OVCAR-5）和成纖維細胞（MRC-5）進行細胞打印，以高通量和可重復的打印方式形成多細胞腺泡，并構(gòu)建出具有空間介導的微腫瘤環(huán)境。Sun等[23]將海拉細胞（HeLa）包封于明膠-藻酸鹽-纖維蛋白原復合水凝膠中進行細胞打印來制備宮頸腫瘤模型，其打印的構(gòu)建體中細胞存活率達到90%，經(jīng)過適當培養(yǎng)后海拉細胞相互遷移并在水凝膠細絲內(nèi)形成細胞聚集體，與二維腫瘤模型中培養(yǎng)的細胞相比，其具有較高的化學抗性和金屬蛋白酶表達能力。雖然目前已經(jīng)利用細胞3D打印技術(shù)成功制造出了簡易的三維腫瘤模型，但未來還需要制造更大的組織模型來研究癌細胞運動和遷移機制。

3 細胞3D打印技術(shù)的發(fā)展前景

隨著科學技術(shù)的不斷進步，越來越多的研究人員預言未來科學的重大進展將發(fā)生在生命科學與快速成型技術(shù)、生物制造技術(shù)、生物科學和材料科學的交叉領(lǐng)域研究上。因此，有關(guān)細胞3D打印技術(shù)的研究不僅對生命科學前沿理論的形成奠定良好的基礎，而且也將極大地促進和推動制造科學、材料科學等眾多領(lǐng)域的進一步深入發(fā)展。

目前，細胞3D打印技術(shù)的發(fā)展機遇與挑戰(zhàn)并存，如開發(fā)新型的生物墨水，使其機械、流變、化學和生物學特性達到所需要打印器官組織的理想要求；標準化生物墨水配方，由于打印功能多樣、結(jié)構(gòu)復雜的組織通常需要進行多類型細胞的同步打印，缺乏標準化的生物墨水無法保證細胞在同類型打印過程中的存活率，極大地提高了細胞3D打印的難度；除此之外，生物墨水的保質(zhì)期較短，長期儲存極其困難，也較大地限制了細胞3D打印的應用發(fā)展。種子細胞的來源是限制細胞3D打印技術(shù)發(fā)展的另一個主要因素，其原因在于選用來自不同供體的細胞可能會導致免疫反應發(fā)生的危險，并且迄今為止還無法使干細胞分化成全部的細胞種類。從細胞3D打印的工藝上來分析，目前細胞3D打印的打印精度不能保證細胞外基質(zhì)和多類型細胞復雜微結(jié)構(gòu)的精確成形，并且對打印后的細胞提供特定生長微環(huán)境并進行功能化誘導，使獨立的細胞個體融合成有功能的組織也需要進一步研究。

在不遠的將來，隨著多學科的整合和技術(shù)突破，諸上問題必將一一解決，細胞3D打印技術(shù)將成為一種主流的生物制造技術(shù)，為實現(xiàn)人類在體外制造與人體內(nèi)組織器官類似的三維構(gòu)建體起到巨大的促進作用；同時也會成為一種非常簡易、快速的醫(yī)療技術(shù)，達到臨床上準確、快速、有效的修復受損組織和替換病死器官的水平，最終造福于整個人類社會。