克氏原螯蝦殼高值化利用的研究進展

蔡一芥,馬申嫣,程佳琦,范海龍,黃建聯,范大明,*

(1.蘇州旅游與財經高等職業技術學校,江蘇蘇州 215104; 2.農業農村部冷凍調理水產品加工重點實驗室,福建廈門 361022; 3.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

克氏原螯蝦,屬甲殼綱動物蝲蛄科,俗稱小龍蝦,原產自于美國的東南部,又名路易斯安那州螯蝦、美國螯蝦,自1918年引入日本后,在1929年由日本輸入到我國湖北、蘇南等地[1],目前主要分布于長江中下游地區,是最具食用價值的淡水龍蝦品種之一。克氏原螯蝦的年產量占我國整個淡水龍蝦產業產量的70%～80%,并逐年增長。在2017年,我國克氏原螯蝦消費量達87.93萬噸,占據餐飲服務產業總產值的75%[2]。

蝦殼是克氏原螯蝦加工后的主要廢棄物,干燥蝦殼由約40%的碳酸鈣,25%～30%的蛋白質,30%～35%的甲殼素以及微量脂類物質等組成[3],但長期以來未能被較好地利用,既浪費資源又污染環境。20世紀90年代初我國小龍蝦加工業初起步,目前我國將小龍蝦加工成蝦仁、蝦尾、原味整蝦及調味龍蝦等幾類產品。除了在國內有較好的銷售量,還將小龍蝦加工產品出口至國外,取得較好的經濟效益。克氏原螯蝦廢棄物生產鏈逐步健全,形成了甲殼素、殼聚糖、蛋白和動物飼料等系列產品[4]。

因此,以克氏原螯蝦蝦殼為原料進行開發利用,不僅可以緩解迅猛增長的克氏原螯蝦產業對環境污染造成的壓力,還可以創造高附加值產品。本文就目前克氏原螯蝦蝦殼開發利用的研究進展展開綜述,總結克氏原螯蝦蝦殼開發利用過程中存在的問題,并指出我國克氏原螯蝦殼工業化生產的開發方向。

1 克氏原螯蝦蝦殼的開發利用

1.1 甲殼素的提取及應用

1.1.1 甲殼素的提取 甲殼素,化學名為聚-1,4-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖或聚-N-乙酰-D-葡萄糖胺,是一種與纖維素化學結構類似的無定型多糖[5],廣泛存在于甲殼綱動物、軟體動物、蟲類、真菌及一些植物的細胞壁中[6],作為一些植物和海洋生物體內的支撐材料而存在,也是自然界中僅次于纖維素的第二大可再生資源[7]。克氏原螯蝦等產生于食品加工業的廢棄物可作為甲殼素工業化生產的原料,并且可根據不同的需求,利用多種方法及輔助手段提取到不同類型的甲殼素及其衍生物[8]。目前常用于提取克氏原螯蝦蝦殼中甲殼素的方法主要為化學法及生物法,且已有研究者通過輔助以超聲波、微波及高壓等來優化提取甲殼素的條件。

1.1.1.1 化學法 化學法又稱酸堿法,化學法提取甲殼素是目前工業上認可度最高應用最廣也最為成熟的制備方法,即在水浴加熱的條件下,按照一定的料液比,加入一定濃度的無機酸溶液脫除蝦殼中的礦物質,脫除礦物質后的蝦殼在流動水下洗至中性后加入一定濃度的堿液,以脫除蝦殼中附著在甲殼素纖維表層的蛋白質,反復水洗至中性后再經高錳酸鉀或雙氧水脫色、洗滌、烘干所得到的白色產物即為甲殼素。通常被用來脫除甲殼中礦物質的酸主要有:稀鹽酸、硝酸、亞硫酸、乙酸和甲酸,其中以稀鹽酸的使用最為普遍,而通常用來處理克氏原螯蝦蝦殼用于脫去蛋白質的堿液一般為低濃度的氫氧化鈉溶液。Bernhabiles等[9]用1.5 mol/L的鹽酸,在室溫條件下反應30 min脫除克氏原螯蝦殼的灰分,研究表明料液比在1∶10～1∶30 (w/v)范圍內對該反應結果影響不顯著;用2 mol/L的氫氧化鈉在料液比1∶20 (w/v)、45 ℃的條件下反應2 h去除蛋白質;將未脫色甲殼素與丙酮溶液以1∶10 (w/v)的比例混合脫色,再用0.315%的NaClO溶液以1∶10 (w/v)固液比將粗產品靜置漂白5 min,得到的甲殼素含灰分和蛋白質分別為0.22%和3.14%。傳統酸堿法提取甲殼素由于操作簡單被廣泛應用于工業生產中,但在該過程中消耗了大量的強酸強堿,且需要經過反復的水洗操作,浪費大量水資源的同時對環境造成了污染,同時生產成本較高。

Kaya等[10]對傳統的酸堿提取法進行了改良,在去礦化和去蛋白質之前使用NaClO兩次處理樣品,該方法可以有效縮短提取時間,提取得到的甲殼素為白色,物理性質與傳統方法提取的較為一致。針對目前傳統方法中存在的不足,朱凱等[11]嘗試先將克氏原螯蝦蝦殼粉碎,接著用復合脫脂劑去除脂類物質,再進行下一步的酸堿處理,通過這一前處理步驟可以大大減少酸堿溶液的用量,使甲殼素產品的品質得到了顯著的提高,同時可減少環境污染和能源消耗。Nguyen等[12]對于已經脫除蛋白質的克氏原螯蝦蝦殼,使用乳酸替代無機酸并輔以微波強化脫除礦物質的方法制備甲殼素,得到的甲殼素脫礦率達99.2%,且其化學結構與商業甲殼素十分相似,脫除的礦物質中鈣含量較高,可作為副產品回收。這一研究成果有利于減少無機酸在提取甲殼素過程中的使用,有效減少蝦殼對環境的污染。

1.1.1.2 酶解法 酶解法,即利用蛋白酶的酶解作用水解甲殼中的蛋白質,由于酶解作用局限于去除蛋白質,因此為了達到同時去除蝦殼中蛋白質和礦物質以提取甲殼素的目的,通常需要在酸或者紅外、超聲波及微波的輔助下共同作用。Valdez-Pe?a等[13]選擇堿性蛋白酶、溶菌酶、風味蛋白酶等5種不同的蛋白酶進行蝦殼酶解實驗,以蝦殼的蛋白質脫除率為指標,篩選出蛋白脫除能力最強的堿性蛋白酶;利用微波的非熱效應輔助堿性蛋白酶提取甲殼素,其中甲殼素的產量為22%,能夠去除61%的蛋白質,僅含有0.2%的灰分。Younes等[14]以堿性蛋白酶為對照,酶解實驗的原料為枯草芽孢桿菌A26(BacillussubtilisA26)、莫海威芽孢桿菌A21(B.mojavensisA21)、麥氏弧菌J1(VibriometschnikoviiJ1)以及棒曲霉ESl(AspergillusclavatusES1)這四個菌種產的蛋白酶,經比較選出具有最佳脫除蛋白質效果的莫海威芽孢桿菌所產的蛋白酶;為優化酶解條件,通過響應面分析確定了用1.5 mol/L鹽酸處理經酶解的蝦殼,最終能得到88%±6%的蛋白質脫除率,灰分含量僅為1.97%,產量為18.5%±2.3%的甲殼素產品。Younes等[15]將蝦殼浸泡在0.5 moI/L的鹽酸中并重復兩次同樣的操作,再將處理后的蝦殼洗凈,分別嘗試使用堿性蛋白酶S.scrofa和A21來各自脫除蛋白質,結果表明這兩種酶各自分別可以實現95%的蛋白質去除率和100%的灰分去除率,與此同時能保留甲殼素自身99%的乙酰度,這一方法實現了將化學法與酶法結合共同提取甲殼素,為實現通過生物法高效而又環保制備甲殼素提供了一種全新的思路。

1.1.1.3 微生物發酵法 微生物發酵法主要是將真菌或細菌進行一段時間的發酵,用其發酵產物有機酸和蛋白酶分別脫除蝦殼中的灰分和蛋白質,這是目前研究生物法制備甲殼素的熱點。乳酸菌是目前常用的一種產酸產蛋白酶菌,葡萄糖分解產生的乳酸能夠自發降低培養基的pH,抑制腐敗微生物的生長,為乳酸菌的生長創造了良好的環境。發酵產物之一的乳酸可與克氏原螯蝦蝦殼中的礦物質反應,生成了乳酸鈣沉淀,經過簡單的水洗步驟便可除去;而發酵產生的蛋白酶則可分解克氏原螯蝦蝦殼中的蛋白質。這兩個步驟的結合實現了通過一步乳酸菌發酵提取甲殼素,發酵參數如接種量、葡萄糖或碳源濃度、發酵時間和反應的初始pH等多個因素都會影響乳酸菌發酵的效率。Mao等[16]用響應面分析法優化嗜熱鏈球菌發酵降解蝦殼的參數,經優化能達到83%的灰分去除率和93%的蛋白質去除率。Ghorbel-Bellaaj等[17]用一株綠膿假單胞菌(L.plantarum),在50 g/L葡萄糖溶液中發酵蝦殼5天,脫礦率達96%,脫蛋白率達89%。Pacheco等[18]用一株植物乳桿菌(P.aeruginosaA2),在10%葡萄糖、5%接種量、初始pH8.0、35 ℃條件下發酵蝦殼144 h,脫礦率達94%,脫蛋白率達91.38%。Liu等[19]發現僅用地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis21886)進行發酵,可以脫除83.1%的蛋白質,而用氧化葡萄糖桿菌(GluconobacteroxydansDSM-2003)發酵可除去95%的灰分,故采用地衣芽孢桿菌和氧化葡萄糖桿菌對蝦殼進行聯合發酵降解,結果發現在混合發酵時,接種地衣芽胞桿菌并在無葡萄糖的條件下發酵,且60 h后接種氧化葡萄糖桿菌并在高濃度的葡萄糖存在的前提下繼續發酵36 h,最終可以達到93.5%的灰分去除率和86.9%的蛋白質去除率。綜上所述,較之于傳統化學法,微生物發酵法的反應條件更加溫和,而且提取得到的甲殼素可保持較穩定的分子結構,并且該反應整體上對環境造成的污染較小。目前研究較多的聯合發酵法能夠在已有的研究基礎上實現更加高效的甲殼素的制備。此外,目前也有研究者嘗試在發酵法提取甲殼素之外回收純化有機鈣、蛋白等一系列副產品。

1.1.2 甲殼素的應用 在溶液中甲殼素能與鉛、汞、鈾等重金屬離子形成螯合物,故其最早被應用為一種金屬離子的螯合劑。后來,又在印染工業被用作助染劑和活性污泥絮凝劑,在農業領域用于土壤改良劑、農藥和肥料,在醫藥行業用于制作手術縫合線、醫用纖維、人工皮膚等[20]。隨著研究的不斷深入,甲殼素應用逐漸滲透到日常生活的多個領域中[21]。Benhabiles等[9]從克氏原螯蝦殼中制備甲殼素及其低聚物,測試其抗菌作用,結果表明甲殼素對革蘭氏陰性細菌,大腸桿菌ATCC 25922(EscherichiacoliATCC 25922),霍亂弧菌(Vibriocholerae),志賀氏痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)和脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)表現出顯著抑菌作用。Chow等[22]通過從甲殼素溶液中生產甲殼素凝膠,然后凍干得到多孔甲殼素基質,制備了一系列多孔甲殼素基質。冷凍干燥之前對甲殼素凝膠不同的各種預處理程序,可獲得100～500 mm的基質孔徑。研究者發現暴露于這些甲殼素基質的小鼠和人纖維細胞培養物正在生長和增殖,表明使用這些多孔甲殼素基質用于細胞移植可以實現組織再生。

1.2 殼聚糖的提取及應用

殼聚糖,是甲殼素經脫乙酰化得到的產物,具有生物可降解性、滲透性、成膜性等多種優良特性[23],故常將提取得到的甲殼素再經一步脫乙酰化制得殼聚糖,以此更好地應用于工業、農業、食品和醫藥等領域。目前殼聚糖的制備主要采用酸堿法,但酸堿法處理時間長,且長時間的堿處理易引起殼聚糖降解使其粘度降低。EL等[24]首次在以蝦殼制備殼聚糖的三個主要步驟:去礦化、脫蛋白和去乙酰化中使用微波輻射替代水浴加熱,并與常規加熱制備甲殼素和殼聚糖進行了對比研究。采用傅里葉變換紅外光譜法對這兩種方法得到的甲殼素和殼聚糖的結構和理化性質,特別是對脫乙酰度進行了表征。結果表明,經24 min的微波輻射,制備的殼聚糖的脫乙酰度可達到82.73%,而使用傳統的水浴加熱方法想要制備具有相同脫乙酰度的殼聚糖則需要6～7 h甚至更長的時間。微波技術使得提取時間大約減少了約1/16。丁恒生等[25]采用堿濃度45%、微波加熱15 min、微波功率280 W制備殼聚糖,發現微波輻射法可快速制備高脫乙酰度、高粘度的殼聚糖,且微波加熱提取速度比酸堿法快十倍以上。加這些結果表明,對于處理蝦殼,微波輻射是一種更節能、更高效和環保的方法。

殼聚糖添加在食品中可控制血脂[26],低聚殼聚糖對鮮肉有保鮮效果[27],酸性殼聚糖對雞蛋有保鮮效果。殼聚糖具有抗菌性[28],可提高巨噬細胞的活性從而抑制癌細胞轉移,被用于制造治療腫瘤的藥物[29]。Zaki等[30]用添加了從克氏原螯蝦蝦殼中提取的殼聚糖的飼料連續飼喂鱸魚30、60和90 d,之后以嗜水氣單孢菌感染鱸魚,發現其明顯提高了抗病能力,且隨飼喂時間延長抗病能力有增強趨勢。齊祥明[31]以從克氏原螯蝦蝦殼中提取的甲殼素為原料進行脫乙酰化,制得殼聚糖,用此殼聚糖絮凝魚糜漂洗水中經等電沉淀后的蛋白質以實現回收,加入殼聚糖370 mg/L,在20 ℃的條件下,可獲得95%的蛋白回收率,此時廢水中剩余的蛋白質量濃度可降至0.37 mg/mL及以下。

1.3 蛋白質、生物鈣的提取及應用

克氏原螯蝦蝦殼中的蛋白質氨基酸成分較為均衡,含人體必需的8種氨基酸,是一種優質的動物蛋白[32]。克氏原螯蝦的附肢及鰓中所含的粗蛋白遠高于大豆、雞蛋和牛肉,蝦頭蛋白質氨基酸種類齊全,脂肪中卵磷脂、腦磷脂、不飽和脂肪酸含量豐富,易于吸收[33]。一般人們提取甲殼質時,蛋白質均溶解于堿液中,失去了蛋白質的利用價值。目前常使用回收蛋白的方法主要有等電點法沉淀法和酶水解法,以此獲取高使用價值的氨基酸營養素。

夏士朋[34]根據蛋白質具有帶電性及其等電點的特征,在經稀堿脫蛋白的處理的蝦殼液中中加入鹽酸調節pH,在等電點處沉淀蛋白,結果表明當pH<5時蛋白質迅速凝聚沉淀,而此后即使pH再降低,蛋白質的析出量也不再發生變化。陳娜[35]以工廠中加工克氏原螯蝦產生的廢棄物為原料,利用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶對其進行水解,篩選得木瓜蛋白酶為其中水解能力最強的酶,并采用正交化分析進一步探究木瓜蛋白酶酶解的最佳工藝參數，結果表明固液比為1∶2.5 g/mL,pH7.5,酶用量6000 U/g,在55 ℃下酶解5.0 h,其水解度可達28.12%;將水解液離心過濾、噴霧干燥即可制得濃縮的蛋白粉,經檢測其所含水分3.2%、灰分3.1%、脂肪3.3%、蛋白質90.2%,可作為調味品、功能食品的補充成分或飼料中蛋白強化添加物使用。

廖曉峰等[36]用胰蛋白酶水解法提取克氏原螯蝦蝦殼中的生物蛋白鈣,經正交試驗得最佳反應條件:酶解溫度50 ℃、pH7.0、加酶量為l%、反應2 h,此時可提取26.6%的生物蛋白鈣,且該產品鈣的含量達5.81%,蛋白質含量可達27.53%,產品可用作高級飼料或補鈣制劑,解決了日益發展的克氏原螯蝦養殖與加工業的中污染和浪費的問題。張文靜等[37]采用胰蛋白酶-檸檬酸法從克氏原螯蝦蝦殼中提取鈣粉,研究缺鈣的大鼠對復合鈣粉的吸收效果，結果表明采用胰蛋白酶-檸檬酸提取復合鈣粉的最佳工藝中為:加酶量2.5×103U/g、酶解pH8.0、酶解時間1.5 h、酶解溫度45 ℃、檸檬酸濃度為0.4 mol/L、檸檬酸用量20 mL、處理時間1.5 h,此時蛋白水解度達57.2%,鈣溶出率為85.8%;提取的復合鈣粉中總氨基酸含量為18.3%,鈣含量為19.6%。復合鈣具有細膩的質地,多呈淡褐色,無異味；該動物實驗表明,大鼠可以較好地吸收蝦殼中提取的復合鈣粉鈣,在灌胃劑量達到66.5 mg/(kg·d)時的復合鈣粉能明顯提高大鼠血清鈣、磷水平,促進大鼠正常生長。

1.4 蝦殼粉在飼料中的應用

由于在加工過程中克氏原螯蝦蝦殼往往被作為廢棄物,故處理時未過多考慮其衛生安全狀態,即使蝦殼中含有豐富的蛋白質、甲殼素、氨基酸、鈣等營養成分,但此狀態已然不適合于人的直接食用,故研究者們嘗試將其經簡單處理后添加到各種動物飼料中,不僅有利于動物吸收生長過程中必須的營養成分,而且沒有造成浪費和污染。最常見的回收利用方法是將克氏原螯蝦蝦殼自然曬干或風干制成易與運輸和儲藏的干粉,添加到水產、畜禽的養殖飼料中強化營養。蝦殼粉可在添加到雞飼料中以替代魚粉,但為避免影響飼養雞體內氨基酸及礦物質平衡需控制蝦殼粉的添加量,蝦殼粉還可以在育肥豬飼料中代替魚粉或肉粉,但因礦物質及甲殼素占比高、脂肪含量低,故熱能不佳,應注意補充熱能及鈣磷平衡的問題[38]。此外,在水產飼料中蝦殼粉也可作為著色劑或誘食劑,但如果品質不佳的蝦殼粉被添加則相應地也會存在反作用,其中葉玉珍[39]在鯉魚飼料中用使用蝦殼粉替代了魚粉,養殖效果甚佳;石天亮等[40]在養殖中華鱉的飼料中用蝦殼粉替代魚粉,發現不僅可以降低配方成本,還可提高中華鱉的免疫力。Fagbenro等[41]以糖或者木薯淀粉加入乳酸菌,在30 ℃條件下發酵克氏原螯蝦蝦殼,可以產出優質的飼料,此法生產的飼料中含有較多蛋白質,故比較適合應用于水產養殖。

1.5 其他應用

克氏原螯蝦蝦殼除了被應用于提取甲殼素、蛋白質,制備殼聚糖等領域,也有一些較為創新的應用。Li等[42]將克氏原螯蝦殼制成生物炭創造性地用于去除三氯乙酸的吸附劑，該合成方法將經ZnCl2溶液改性的克氏原螯蝦殼制備ZnO-CFS600。基于Langmuir模型,通過分批吸附測定ZnO-CFS600對三氯乙酸的去除效率,最大吸附容量為17.8 mg/g,與現有研究相比吸附量顯著增加。Cai等[43]首次將源自蝦殼廢料的生物堿作為固體燃料電池的電解質,該電解質在450～550 ℃的溫度范圍內表現出良好的性能,當使用該電解液在恒電流操作期間電池的電壓保持恒定值超過10 h,所制備的燃料電池的實際潛力也得到驗證。宋慶洋等[44]比較了丙酮、無水乙醇和石油醚對克氏原螯蝦殼中蝦青素的提取效果,實驗表明在丙酮料液比為1∶20、溫度30 ℃、時間2 h、重復提取兩次條件下,蝦青素加標回收率可達99.2%。

2 克氏原螯蝦殼高值化利用中存在的問題

目前大部分廢棄的克氏原螯蝦蝦殼都被應用于提取甲殼素,但化學法提取甲殼素使用了大量的強酸強堿,對環境有著一定的危害,同時整個提取過程耗時較長,存在明顯的缺陷。同時在提取甲殼素的過程中,由于使用了較多的強酸強堿導致溶出的蛋白質發生了變性,無法回收,失去了部分具有一定價值的副產物。盡管已經有研究者提出可以使用生物法來替代化學法提取甲殼素,但生物法由于條件過于溫和導致處理量小、耗時長,不適合應用于工業生產中,綜上可以看出單純地使用化學法或生物法提取甲殼素都不能較好地滿足工業生產的需要。有研究者提出使用微波、超聲波等技術輔助化學法改進提取工藝,但就微波輔助而言,現有的研究沒有考察在同樣的水浴和微波升溫曲線條件下提取的甲殼素的質量,因此所得的結果與傳統方法提取甲殼素沒有可比性。

此外,克氏原螯蝦蝦殼的部分利用方向的開發研究還較為滯后,例如說從蝦殼中提取多不飽和脂肪酸、提取及利用蝦青素、開發蝦味香精調料等高附加值產品等,都有待進一步研究,這一點不僅需要經濟的支持還需要堅實有力的技術支持。隨著科學技術的發展,對克氏原螯蝦蝦殼的開發利用方式也逐漸增多,但目前多數對于克氏原螯蝦蝦殼的開發利用仍然僅停留在實驗室研發階段,其工藝參數與真正投入工業生產還有較大的差距。

3 展望

作為克氏原螯蝦的消耗大國,充分挖掘克氏原螯蝦蝦殼的潛在價值,具有實現對克氏原螯蝦蝦殼的充分利用和有效地緩解蝦殼產生的環境污染的雙重意義。由于實驗室研究是微量且精細化的,與實際的工業化大規模生產之間存在諸多不同,如果要將已有的實驗研究成果轉化為工業生產,還需要進行大批量放大實驗,并在放大實驗的過程中制定產品品控標準,檢測參數指標的變化,并隨之調整相應的工藝條件。

今后,克氏原螯蝦蝦殼的開發方向主要有:a. 甲殼素的工業化生產研究,分析甲殼素工業化生產工藝優化問題,減少化學法提取過程中酸堿的使用量并且能夠縮短提取時間,以投入工業中實現大規模的生產,充分發揮克氏原螯蝦蝦殼的潛在經濟價值。擬根據現有的較為成熟的水浴加熱的參數,擬合其升溫曲線,設置相應的微波程序,精確考察在同種升溫條件下,微波的應用對于甲殼素的提取時間、提取率及產品甲殼素質量的影響。b. 對克氏原螯蝦蝦殼進行分部位提取甲殼素,主要是提高甲殼素的純度。c. 克氏原螯蝦蝦殼粉作為飼料原料,從蝦殼中提取多不飽和脂肪酸、蝦青素,開發蝦味香精調料等高附加值產品等的應用研究,提高克氏原螯蝦蝦殼的利用率和回收率,同時也可對市場上現有蝦類產品進行補充優化。