Ca2＋信號通路調控肌纖維類型轉化的研究進展

侯普馨，侯艷茹，白艷蘋，蘇 琳，趙麗華，靳 燁*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

肌纖維是肌肉組織的基本組成單位，其類型是決定肉品品質的一個重要因素。肌纖維的密度、數量、直徑、橫截面積、不同類型肌纖維的數量比例以及面積比例都與肉品品質密切相關[1]。特別是當肉品中氧化型肌纖維所占比例高時，肌肉的pH值、肉品的風味、顏色、大理石紋評分和肌內脂肪含量較高，肌肉系水力強、細嫩多汁、肉質良好。目前通過改變肌纖維類型組成從而改善肉品品質已經成為肉品科學領域的研究熱點[2]。

骨骼肌的可塑性較強，當機體受到刺激時，骨骼肌能夠激活細胞內相關的信號通路，使肌纖維特異性基因的表達改變，從而使得肌纖維類型發生改變以適應需求[3]。大量研究均表明，肌纖維類型的轉化遵循I型（慢收縮氧化型）→IIa型（快收縮氧化酵解型）→IIx/d型（中間型）→IIb型（快收縮酵解型）的轉化路徑。肌纖維類型的轉化受到多種信號通路的調控，如單磷酸腺苷活化蛋白激酶通路、過氧化物酶體增殖物激活受體通路、Wnt/β-連環蛋白通路、大鼠肉瘤蛋白/細胞分裂素活化蛋白激酶通路等。研究較多的兩條途徑分別為鈣調神經磷酸酶/T細胞核因子（calcineurin/nuclear factor of activated T cells，CaN/NFAT）和生肌調節因子途徑，其主要是細胞內Ca2＋濃度和代謝產物的變化激活了下游信號分子通路，從而調節與肌纖維類型相關的基因，引起肌纖維類型發生轉變[4]。本文總結了CaN與鈣調蛋白激酶（calmodulin kinase，CaMK）的組成結構、Ca2＋信號通路調控肌纖維類型轉化的作用機理、影響Ca2＋信號通路調控的主要因素以及Ca2＋信號通路與肉品品質的關系，以期為今后通過遺傳、營養等措施改善肉品品質提供理論依據。

1 Ca2＋信號通路

Ca2＋信號通路包括CaN和CaMK兩條Ca2＋依賴性信號傳導途徑，其被激活都會促進快肌纖維向慢肌纖維轉化。

CaN又稱蛋白磷酸酶2B，是迄今為止發現的唯一受Ca2＋/鈣調素（calmodulin，CaM）活化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶[5]。在20世紀70年代末至80年代初，美國和加拿大的研究者在豬腦中發現CaN并將其分離純化，后來逐漸發現其幾乎分布在不同組織和多種類型的細胞當中[6]。CaN是由分子質量約為59 kDa的催化亞基（CnA）和分子質量約為19 kDa的調節亞基（CnB）按1∶1比例形成的異型二聚體。CnA的氨基端是磷酸酶結合域，中間是CnB和CaM的結合域，羧基端是自抑制域。CnA是全酶催化的核心，CnB和CaM可將其激活[7]。無刺激狀態時，自抑制域形成α-螺旋封閉酶的底物結合區域，此時α-螺旋封閉酶處于失活狀態；當它被CnB和Ca2＋/CaM結合到對應的結合位點時，抑制域結構發生改變，活化位點暴露出來，從而引起變構反應，此時α-螺旋封閉酶被激活[8]。

CaMK則是一種絲氨酸/蘇氨酸特性的蛋白激酶，被鈣/鈣調蛋白復合物所調節[9]。CaMK包含一個氮末端的催化區、一個調節區和一個聯合區[10]。

2 Ca2＋信號通路與肌纖維類型轉化

2.1 CaN途徑

1993年Jain等研究發現NFAT可以被CaN脫磷酸化[11]。1996年Schreiber等通過免疫應答反應發現了CaN是免疫抑制劑環孢菌素A（cyclosporin A，CsA）、他克莫司（tacroclimus，FK506）的靶向蛋白，且CsA能阻礙NFAT的移位[12]，這使得CaN逐漸成為研究熱點。1998年Chin等研究得出骨骼肌中的CaN可以選擇性上調慢肌纖維特異性基因的啟動子；相反，加入CsA能抑制CaN的活性而導致慢肌纖維向快肌纖維的轉化，并推測是由NFAT和肌細胞增強因子（myocyte enhancer factor，MEF）2家族的蛋白質組合機制介導慢肌纖維特異性轉錄[13]。2000年Naya等通過調控肌酸激酶構建了表達CaN活性的轉基因小鼠，研究證明在體內活化的CaN能誘導慢肌纖維的基因表達，且單獨活化CaN不足以引起骨骼肌肥大[14]。2006年Miyazaki等以8 周齡的雌鼠為實驗材料，先將其后肢懸浮處理8 周，隨后再負載4 周并給予腹腔注射CaN抑制劑FK506，通過對比目魚肌的檢測發現，在后肢懸浮期間，肌肉明顯萎縮且有慢肌纖維向快肌纖維轉化的趨勢。在再負載時，肌肉開始生長，比目魚肌又向慢肌纖維逆轉，FK506的灌注會抑制CaN的活性從而阻止慢肌纖維的維持和再生[15]。因此，CaN在維持和懸浮再負載的慢肌纖維中都發揮重要作用。2007年Mu Xiaodong等運用微陣列追蹤骨骼肌特異性基因的表達，研究發現靜息培養小鼠趾短屈肌3 d，會發生快肌纖維向慢肌纖維的轉化，如果加以電刺激模擬神經支配，轉化會進一步加快，但過表達CaN卻不能使轉化徹底進行[16]，這也表明CaN途徑在肌纖維特異性表達與轉化機制中是必不可少的。2010年Yuan Yuan等發現在C2C12成肌細胞中，組成性活化的FoxO1突變體改變了肌纖維的組成比例，使得肌纖維向快速酵解型轉變，并降低了CaN的活性[17]。一系列小鼠模型實驗均證明，抑制CaN活性使得大鼠比目魚肌中Ⅰ型肌纖維比例下降，Ⅱ型肌纖維比例升高[18]；敲除CaN基因也會得到同樣結果；過表達CaN基因使氧化型肌纖維比例升高，酵解型肌纖維比例降低[19]，這均表明CaN對慢肌纖維基因的調控發揮著重要作用。綜上所述，CaN在肌纖維類型轉變、骨骼肌分化過程中發揮著重要作用，是骨骼肌重塑的重要信號分子。其他研究還表明，CaN參與糖代謝、脂肪酸氧化、血管平滑肌細胞增殖、細胞因子產生等過程[20]。

隨著研究的深入進行，CaN和轉錄調節相偶聯的作用機理逐步被揭示出來。CaN的主要作用底物是NFAT，在NFAT的作用下，可以提高多種表達Ⅰ型肌纖維的基因表達水平[21]。在體內，骨骼肌受到運動神經支配，運動神經元引發肌纖維產生動作電位。在慢肌纖維中，神經沖動引起細胞質中Ca2＋長期持續的低振幅變化，這種變化能夠激發肌細胞內Ca2＋濃度不斷升高，使得細胞中的Ca2＋濃度維持在100～300 nmol/L，此時Ca2＋與CaM相結合激活CaN，使得NFAT去磷酸化，暴露核定位信號，NFAT從細胞質轉位到細胞核，與其他轉錄因子協同調節在慢肌纖維中特異性表達基因的活化，促使慢肌纖維表達。而在快肌纖維中，神經沖動引起細胞質中Ca2＋短期持續的高振幅變化，使Ca2＋濃度維持在較低水平（低于50 nmol/L），該條件下不足以激活CaN，也就不能使NFAT去磷酸化入核，不能發揮對快肌纖維基因表達的調控[22-23]。對此，一些研究者也提出異議，2000年Swoap等發現在C2C12肌管中超表達CaN，可以同時激活慢肌和快肌的啟動子，然而超表達NFAT卻不能誘導快肌/慢肌特異啟動子的表達[24]。2001年Allen等研究發現在快肌纖維的啟動子區域包含多種NFAT的結合位點，超表達CaN可以活化這些快肌纖維基因[25]。CaN途徑涉及多種調控因子的參與，且肌纖維的發育受到多種因素的影響，具體的調控機制還有待進一步探索驗證。

2.2 CaMK途徑

2008年Smith等通過大鼠游泳實驗發現，游泳運動后大鼠葡萄糖轉運子4（glucose transporter 4，GLUT4）mRNA和蛋白質均顯著增加。若運動前給大鼠腹腔注射KN93（CaMK抑制劑），則導致CaMK磷酸化、組蛋白H3乙?；?、MEF2A結合與GLUT4的表達降低或消除[26]。2012年Ou Na等用馬血清誘導C2C12細胞分化，用低頻率慢型電刺激結合CsA或KN93處理，得到CsA和KN93能夠抑制體外C2C12細胞分化模型中肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）I mRNA和蛋白質的表達，且證明低頻率慢型電刺激處理可以促進MyHCⅡ的轉化[27]。因此CaMK在調控肌纖維類型轉化中也發揮重要作用。

肌纖維中瞬時升高的Ca2＋濃度可以將CaMK激活，在磷酸化組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）的作用下從細胞核轉移至胞漿，進一步活化MEF2，參與I型肌纖維基因轉錄的調控。激活的CaMK還可以通過腺苷-3’,5’-環化一磷酸應答元件結合蛋白結合到過氧化物酶體增殖物激活受體輔助活化因子（transcriptional peroxisome proliferator-activated receptor α coactivator-1，PGC-1α）啟動子上，進而調控肌纖維類型轉化[28-29]?，F已發現CaMK家族包括CaMK I～IV 4 個成員，研究認為只有CaMK II、IV參與快肌纖維向慢肌纖維的轉化過程[30]。CaMK II可引起與肥大反應相關的血清反應因子磷酸化，其可促進葡萄糖運輸，提高氧化能力。在心肌細胞中，CaMK IV在256～498氨基酸殘基上磷酸化HDACs，并從MEF2結合位點上解離，暴露與其他蛋白相結合的位點，移位進入細胞質，這一過程通過染色體區域穩定蛋白1依賴性出核運輸機制實現[31]。2007年在Mu Xiaodong等進行的趾短屈肌細胞培養實驗中發現，雖然肌肉表型已發生轉變，但CaMK IV活性并沒有改變[16]。2004年Akimoto等證實了在小鼠的骨骼肌中不表達可以檢測的CaMK IV蛋白活性，因此推測CaMK IV可能不是維持MyHC IIb向MyHC IIa轉換所必需的介質，與之協同作用的其他蛋白激酶可能作為參與肌纖維類型轉化的內源性介質[32]。且2004年Wright等在大鼠肌肉中也未證實CaMK IV mRNA的存在[33]，因此CaMK的作用機理還存在爭議。

2.3 影響Ca2＋信號通路調控的因素

目前對于CaN和CaMK途徑的研究主要集中于調控肌纖維發育的關鍵轉錄因子、功能基因、相關抑制劑以及運動對其影響的研究。在轉錄因子中，CaN的主要作用目標是NFAT家族成員和MEF2，且MEF2也是CaMK途徑的研究重點。

2.3.1 活化T細胞核因子

NFAT是一種轉錄因子，最初被發現于參與T細胞的信號傳導。迄今共發現5 種NFAT亞型，分別為NFATc（NFATc1或NFAT2）、NFATp（NFATc2或NFAT1）、NFAT4（NFATc3或NFATx）、NFAT3（NFATc4）、NFAT5[34-35]。CaN主要是基于NFATc1發揮作用，促進慢肌纖維的生長、修復，抑制快肌纖維肌球蛋白重鏈基因的表達[36]。2000年Swoap等發現NFAT能選擇性應答慢型小α運動神經元的活動[24]。1998年Chin等發現一些慢肌特異性基因的調控區含有NFAT和MEF2因子的結合位點[13]。2004年Mccullagh等將合成的肽抑制子導入比目魚肌中，導致CaN無法激活NFAT，使得MyHC I型基因表達下調，IId/x型肌球蛋白重鏈表達上調[37]，這揭示了在慢型肌球蛋白重鏈基因的表達中NFAT活性的必要性。2013年Yamaguchi等通過過表達實驗和siRNA介導的干擾實驗證實NFATc2和NFATc4參與著MyHC I的調控，敲除NFATc1時會引起心臟發育缺陷而導致胚胎死亡，敲除NFATc2和NFATc3會引起肌肉萎縮[38]。在嚙齒動物骨骼肌細胞快肌纖維向慢肌纖維轉化過程中，MyHC I基因表達的上調與NFATc1參與有關[39]。2013年Vechetti-Júnior等對大鼠進行了8 周的游泳耐力訓練，與不運動的對照組相比，有氧運動誘導了比目魚肌中肌纖維由I型向IIa型轉化，趾肌中肌纖維由IIb型向IIa轉化，且NFATc1-c3基因表達增加，而NFATc4和CaN的表達量沒有改變，由此證明了有氧運動引起的肌纖維類型轉化是由NFATc1-c3介導的[40]。

2.3.2 肌細胞增強因子

MEF2是最早發現于骨骼肌肌管中的一種蛋白質，在脊椎動物中包括MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D 4 個成員[41]。作為一種關鍵的生肌調控轉錄因子，MEF2可以激活肌肉特異基因的表達從而促進骨骼肌的發育[42]。CaN可以通過MEF2和PGC-1α啟動子上MEF2-BS位點結合后調節肌纖維類型的轉化[43]。2007年Potthoff等通過轉基因小鼠發現過表達MEF2可以促進小鼠慢肌纖維的形成，當添加MEF2特異性抑制劑來抑制其活性時則降低了小鼠慢肌纖維的形成[44]。2009年Hennebry等研究發現，肌肉生長抑制劑在促進慢肌纖維形成時，可以上調MEF2C的水平，但負調控成肌分化抗原的表達[45]。

2.3.3 運動

運動可以通過調節CaN途徑影響肌纖維類型的轉化[3]。2008年廖八根等通過耐力運動實驗發現，CaN參與肌纖維類型和大小的調控[46]。2010年吳金富研究發現再負荷離心運動可以激活細胞中Ca2＋，并通過CaN調節肌纖維類型的轉化[47]。2017年尹麗琴等通過對大鼠高、中等強度的運動實驗得出運動可以提高CaN的活性及NFATc1蛋白質的表達[48]。當機體持續處于低能量負荷的耐力運動時，骨骼肌細胞內Ca2＋濃度持續上升，CaMK被激活，MEF2活化，從而誘導慢肌纖維表達[49]。對人進行自行車運動強度測試，發現運動1 min內，CaMK II活性迅速升高，并隨著時間延長持續升高，運動強度提升使其活性升高更快[50]。2000年Flück等對大鼠進行輪跑運動實驗發現運動可以使得大鼠股外側肌CaMK II活性升高[30]。這些研究均表明運動可以提高CaMK的活性，進而促進肌纖維類型發生轉化。

2.3.4 其他

越來越多的研究表明，胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）在動物發育，特別是骨骼肌發育中發揮重要作用。2013年Hudson等研究發現IGF-1能激活CaN及其底物NFAT，在調節肌纖維類型轉化以及促進肌管的增殖和肥大中發揮著重要作用[51]。1999年Musarò等給有絲分裂后期的大鼠L6E9骨骼肌細胞轉染IGF-1基因，引起肥大肌纖維中CaN亞基的基因轉錄和細胞核定位[52]。2015年束婧婷等研究得出IGF-1、CnAα、NFATc3 3 個基因在鴨早期骨骼肌中協同表達，在腓腸肌外側頭肌纖維類型存在由酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉化的趨勢[21]。

環孢霉素A是CaN的特異性抑制劑，可以抑制低頻電刺激誘導的II型肌纖維向I型肌纖維轉化。2001年Serrano等用環孢霉素A和免疫抑制劑FK506抑制CaN的活性，發現在比目魚肌再生初期，MyHC IIa表達量增加，MyHC IIx、MyHC IIb表達量下降[53]。

在近些年的研究中，Sharlo等發現，功能卸載的大鼠比目魚肌中的NO水平下降，會激活糖原合成酶激酶-3β，從而促進NFATc1從細胞核輸出和快肌球蛋白的穩定。而機體內的NO由一氧化氮合成酶合成，這就可以猜測一氧化氮合成酶也參與了慢肌纖維的形成過程[54]。Fajardo等驗證了過表達肌脂蛋白以及肌漿網Ca2＋-ATP酶調節劑能夠刺激CaN信號途徑從而增強骨骼肌的氧化能力[55]。Lomonosova等通過將大鼠后肢懸吊使得其骨骼肌功能卸載，發現在該條件下MyHC I型的表達下降，而上調IIa、IIb和IId/x型表達[56]。

3 Ca2＋信號通路與肉品品質的關系

Ca2＋信號通路對肌球蛋白重鏈的表達具有調控作用，CaN途徑與CaMK途徑均能促進酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉化，該通路被認為是影響慢肌纖維肌球蛋白重鏈亞型表達中最重要的一條信號級聯放大通路[57]。了解Ca2＋信號通路調控肌纖維類型轉化的機制非常重要，其有望為改善畜禽肉品品質提供新途徑。

肉品品質指標包括感官指標、食用指標、衛生指標、營養指標等，通常在食用安全的情況下，消費者會選擇有光澤、有大理石花紋、肌肉細嫩多汁的肉[58]，而肌纖維類型對這些肉品品質性狀均有影響。氧化型（I和IIa型）肌纖維與酵解型（IIb）肌纖維的組成及增長趨勢對產肉量、營養成分含量、質構特性具有直接的影響。肌肉中氧化型肌纖維所占比例越大，酵解型肌纖維比例越小，肌肉品質越高[59]。肌纖維類型對肉品品質影響主要包括嫩度、系水力、風味、色澤等。

肉的嫩度是消費者最重視的食用品質之一，它決定了肉在食用時口感的老嫩。肉的嫩度在本質上取決于肌纖維類型、直徑、密度等因素。氧化型肌纖維形態纖細，而酵解型肌纖維直徑較粗，因此肌肉的剪切力會隨著酵解型肌纖維比例的增多而增大，嫩度則下降[60]。Ryu等研究發現肉的嫩度、色澤與氧化型肌纖維含量呈正相關，而與酵解型肌纖維含量呈負相關，這說明酵解型肌纖維含量所占比例越大，肉品品質越差[61]。肌肉中Ⅰ型肌纖維的含量與肉品品質的多汁性和風味呈正相關[60]。與酵解型肌纖維相比，氧化型肌纖維有更高含量的磷脂，磷脂是決定肉品風味的重要因素[62]。氧化型肌纖維中含有豐富的肌紅蛋白和血紅蛋白，因此當氧化型肌纖維所占比例高時，肌肉呈現鮮紅色[63]。而酵解型肌纖維中肌紅蛋白的含量低，有較高活性的ATP酶和較多的糖原，當酵解型肌纖維所占比例高時，肌肉會顯得蒼白，宰后胴體pH值下降速度快，甚至產生灰白肉[64]。因此，當肉品中氧化型肌纖維所占比例高時，肌肉的pH值、肉品的風味、顏色、大理石紋評分和肌內脂肪含量較高，肌肉的系水力強，肌肉細嫩多汁，肉質良好。

4 結 語

綜上所述，CaN和CaMK信號途徑在肌纖維類型轉化中均發揮重要作用。近年來，隨著生物技術的迅速發展，許多研究者開始從基因組學、蛋白組學方面入手研究與肌纖維類型轉化相關的特異性表達的基因以及信號通路，從而深入揭示其調控機制。但就目前而言，CaN與CaMK活性/含量對肉品品質的影響的相關研究還不夠深入，對于參與Ca2＋信號通路的調控因子以及該通路與其他信號通路間的具體聯系，也有待進一步探索與研究。深入研究該通路中的重要調控因子及差異表達的基因，將有助于今后通過遺傳、營養等措施改善肉品品質。