玉米赤霉烯酮新型生物傳感器檢測技術研究進展

譚紅霞，馬良，郭婷，陳露，劉微，謝盛莉

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN，又稱ZEA，F-2毒素)，是由不同絲狀真菌如禾谷鐮刀菌、鐮刀菌和鐮孢鐮刀菌產生的一種非甾體霉菌毒素，是全球玉米、大米、小麥和其他谷物中最常見的真菌毒素之一[1]。ZEN是內分泌干擾分子，對動物和人類有外源性雌激素作用，易導致不孕癥、流產以及青春期前女孩兒早熟[2]。此外，ZEN還具有血液毒性、肝毒性、遺傳毒性、免疫毒性、基因毒性以及致癌性，ZEN與子宮內膜增生，子宮內膜腫瘤以及宮頸癌有關，國際癌癥研究機構已將其列為Ⅲ類致癌物[3]。

ZEN主要污染谷物(例如玉米，大麥，黑麥，小麥和高粱中)，在食用油，香料，牛奶，啤酒，飲用水，早餐麥片，面包，意大利面等中也可以檢測到ZEN[4]。研究發現，巴西、歐洲、地中海、亞太地區以及地中海等地區，在大麥、啤酒、高粱、稻谷、食用油等中，ZEN的陽性檢出率均高于60%[5-6]。在2012～2014年，中國中部地區的飼料樣品的污染水平為90.2%[7]。在2013～2015年間從中國各省收集的飼料原料和全飼料中，ZEN陽性樣本的百分比為92.3%[8]。在另一項中國調查中，2016～2017年間不同省份飼料中ZEN的發生率為88%，平均濃度范圍為2.3～729.2 μg/kg，其中10.8%的樣品超過我國國標規定的限量濃度(60 μg/kg)[9]。ZEN的污染范圍較廣，可以通過植物來源的食物直接進入人類食物鏈，間接通過動物來源的食物進入人類食物鏈[10]。據報道，嬰兒和兒童比成年人更容易受到ZEN的影響[11]。為了保護消費者的健康，歐盟限定了食品中ZEN的最高殘留量，未加工的玉米中為350 μg/kg，以玉米食物和谷物為基礎的嬰兒食品中為20 μg/kg[12]。中國的谷物及其制品的最高殘留限量為60 μg/kg[13]。為了食品安全和畜牧業的發展，迫切需要探索靈敏、快速和便捷的分析方法來監測食品中威脅人體健康的ZEN。

生物傳感器是指以生物成分(DNA，真菌毒素抗體，酶，微生物，細胞，組織等)為敏感元件，經分子識別，發生生物學反應，產生的信號繼而被相應的物理或化學換能器轉變成可定量和可處理的電化學、光學、電磁學等信號，再經二次儀表放大輸出，便可知道待測物的濃度。通常根據分子識別元件或信號轉換方式來對生物傳感器分類或命名為：信號傳導型生物傳感器、分子識別型生物傳感器[14]。基于生物傳感器的檢測技術具有高專一性、高選擇性、高靈敏度、便攜性和實時分析的性能，在ZEN檢測方面具有很好的發展前景。目前，針對檢測真菌毒素的生物傳感器技術已有較多的研究，主要集中在黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)[15]、赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)[16]、脫氧雪腐鐮刀烯醇(deoxynivalenol, DON)[17]、ZEN等毒素，其中ZEN的檢測是近幾年的研究熱點之一。本文總結了用于ZEN檢測的信號傳導型生物傳感器(電化學生物傳感器、表面增強拉曼散射傳感器、表面等離子體共振生物傳感器、熒光生物傳感器)、分子識別型生物傳感器(核酸適配體生物傳感器、細胞傳感器)，并分析了目前存在的問題和未來研究的趨勢。

1 信號傳導型生物傳感器

1.1 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器通常以電極作為轉化元件，ZEN抗體、ZEN適配體、酶等生物分子作為識別元件，將生物分子間特異性識別產生的各種物理、化學等信號轉換成電阻、電位、電流或電容等物理形式作為特征檢測信號輸出，從而實現小麥、飼料、玉米等樣品中ZEN的檢測[18]。納米材料放大技術、酶催化放大技術等信號放大策略運用到傳感器中是提高ZEN檢測的靈敏度最常用的方法。

基于納米材料放大技術的電化學生物傳感器應用的納米材料主要有碳納米材料、鈀納米材料、金納米材料、多壁碳納米材料等。LIU等[19]利用金銀鉑納米粒子的高電子轉移速率和介孔碳合適的孔排列和優異的導電性，對玻碳電極進行修飾，建立了電流型免疫傳感器，該傳感器表現出低檢測限(1.7 pg/mL)，寬線性范圍(從0.005～15 ng/mL)以及良好的穩定性，重現性和選擇性。AFZALI等[20]采用鈀納米顆粒和導電聚合物離子液體組成的聚合物納米復合材料對玻碳電極進行改性，提高了傳感器對ZEN的電催化活性。目前，納米材料放大技術中多壁碳納米管是研究較多的納米材料。AFZALI等[21]利用多壁碳納米管修飾改性后的碳糊電極，檢出限為0.58 ng/mL。RIBERI等[22]利用碳納米管/聚乙烯亞胺分散體修飾碳網印刷電極，開發電化學免疫傳感器,對玉米樣品中的ZEN進行檢測，檢測范圍為1×10-4～1×10-1ng/mL，檢測限(0.15 pg/mL)和靈敏度(2 pg/mL)方面表現出非常好的分析性能。LIU等[23]采用多壁碳納米管和金-鉑納米粒子修飾的玻璃碳電極上，并且利用葡萄球菌蛋白A將抗體定向固定在電極上，研發了安培型電化學傳感器，該方法顯示從0.005～50 ng/mL的線性范圍，檢測限為1.5 pg/mL，為實際食品樣品中ZEN的監測提供了一種可行，可靠的方法。SADRABADI等[24]首次利用聚二烯丙基二甲基氯化銨修飾的多壁碳納米管將石墨電極改性，同時引入DNA，利用ZEN與DNA在電極表面的相互作用通過腺嘌呤信號的變化來檢測牛奶和小麥樣品中的ZEN，該傳感器方法檢測限可以低至0.005 ng/mL。

酶催化放大技術也是電化學信號放大技術中運用較成熟的技術之一，通過催化底物發生氧化還原反應產生的電子傳遞來增強電化學信號，能夠顯著提高電化學生物傳感器的靈敏度。常用的酶有葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。XU等[25]利用堿性磷酸酶放大技術，建立了電化學間接競爭免疫傳感器，該傳感器的設計與檢測原理如圖1所示。首先，由羧基官能化的cMWCNTs/Chit修飾玻碳電極以擴增免疫傳感器信號并降低檢測限，將ZEN-牛血清白蛋白(ZEN-BSA)與活化的cMWCNTs/Chit膜共價偶聯，在過量的ZEN抗體固定化過程中，ZEN-BSA與游離ZEN之間發生間接競爭。與抗體-堿性磷酸酶一起孵育后，當將α-磷酸萘酯底物加入作為氧化還原介體的二乙醇胺緩沖液中時，用差示脈沖伏安法進行測量。用該傳感器對谷物和飼料樣品中ZEN進行測定，具有較高的靈敏度，線性范圍為10～1 000 ng/mL，檢測限為4.7 pg/mL。

EDC+NHS-交聯劑；α-NP；α-磷酸萘酯；cMWCNTs/Chit-多壁碳納米管和殼聚糖組成的納米復合材料圖1 電化學免疫傳感器的傳感示意圖Fig.1 Sensing diagram of electrochemical immunosensor

將光電化學分析技術(photoelectrochemical, PEC) 和和電化學發光技術(electrochemiluminescence, ECL)應用到電化學生物傳感器中進行信號放大，提高檢測靈敏度也是目前研究熱點之一。PEC是指將光化學與電化學合并，利用光作為激發光源和光電流作為檢測信號的檢測方式[26]。在PEC檢測中，利用光來激發光敏物質，并且電信號被轉換為檢測讀數，使用兩種不同形式的信號進行激發和檢測，由于與其相關的背景減少，該技術具有潛在的高靈敏度。LIU等[27]采用光電化學分析技術，利用有序介孔氧化鈷的氧化還原催化特性及多巴胺修飾二氧化鈦微晶體形成自增強光電陰極矩陣，從而研發了靈敏的光電化學免疫傳感器，對糧食及飼料中的ZEN進行測定。該傳感器的線性范圍為1×10-6～20 ng/mL，并且特異性，精密度和重復性好。ECL技術因其靈敏度高，儀器簡單，ECL反應可控性強，成本低等特點，在分析檢測中具有很好的發展前景[28]。ZHANG等[29]采用電化學發光技術，在四方金紅石型TiO2介晶的雙重作用下，建立了一種新型三明治型電致化學發光免疫傳感器，實現了ZEN的靈敏檢測，用于牛奶樣品中ZEN的檢測，回收率在94.2%～100.1%，重要的是，該方法可能為其他毒素檢測開辟了一條新途徑。

1.2 表面增強拉曼散射傳感器(surface-enhaced raman scattering, SERS)

SERS是以生物成分為敏感元件或探測對象，研究生物分子間相互作用的重要工具之一，可以提供一個非破壞性和超靈敏的檢測甚至低至一個單一的分子水平。LIU等[30]利用競爭性免疫反應，研發了表面增強拉曼散射傳感器，并且成功應用于ZEN污染的多種天然飼料樣品的分析，檢測范圍為1～1 000 pg/mL，檢測限為1 pg/mL，具有很大的實際樣品檢測潛力。該傳感器的設計與檢測原理如圖2所示。

圖2 表面增強拉曼散射傳感器的檢測原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of detection principle of surface-enhanced Raman scattering sensor

第一步(圖2-A)，制備SERS納米探針。第二步(圖2-B)，進行競爭性SERS免疫測定。相同體積的ZEN標準溶液和SERS納米針同時滴在捕獲基質的凹面上，此時固定在捕獲底物上的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白與懸浮在SERS納米探針上的ZEN抗體競爭偶聯標準溶液中的ZEN抗原。如果納米探針在捕獲底物上結合，則顯微拉曼光譜儀可從底物獲得4,4’-聯吡啶拉曼信號，檢測樣品中的ZEN。

1.3 表面等離子體共振生物傳感器(surface plasmon resonance, SPR)

SPR促進了在換能器表面上發生的表面受限分子相互作用的檢測，具有連續實時響應，無標記使用，高特異性和靈敏度等許多優點。EDUPUGANTI等[31]通過噬菌體分離重組玉米赤霉烯酮的單鏈抗體，研發了表面等離子體共振生物傳感器，對高粱中的ZEN進行檢測，檢測限和定量限分別為(7.8±0.07) ng/mL和(13±0.03) ng/mL。HOSSAIN等[32]研發了多重表面等離子體共振生物傳感器，并用于檢測大麥中的嘔吐毒素，ZEN，T-2毒素，赭曲霉毒素A，煙曲霉毒素B1和黃曲霉毒素B1，回收率和檢測限均較為理想。

JOSHI等[33]通過金納米顆粒放大SPR的信號，利用競爭性免疫反應，建立成像表面等離子體共振生物傳感器。該傳感器對小麥樣品中的ZEN進行檢測，檢測限為24 μg/kg，平均回收率為87%～103%，與常見的真菌毒素及類似物未見交叉反應。此外，該傳感器方便、快捷，只需要17.5 min。

1.4 熒光生物傳感器

熒光生物傳感器是以光學信號作為最終檢測信號的一類傳感器，當目標分析物加入后，可引起傳感器中的熒光納米感知識別元件(敏感元件)或熒光納米傳導元件(換能量)的熒光性質或參數發生改變，根據發生的

改變與目標分析物的結構或濃度所反映出的定量關系來檢測目的分析物。WANG等[34]結合熒光偏振免疫分析，建立了熒光生物傳感器，對玉米種霉菌毒素進行檢測，檢測限及回收率均較為理想。ZHANG等[35]研發了基于新型單克隆抗體的熒光生物傳感器，用于玉米中ZEN的檢測。該傳感器檢測限為12 μg/kg，回收率范圍為84.6%～113.8%，加標樣品的變異系數在15.3%以下。LIU等[36]利用生物素-鏈酶抗生物素系統提高靈敏度，建立了熒光生物傳感器，對玉米粉和以玉米基礎的嬰兒食品中的ZEN及其衍生物進行檢測，ZEN的半數抑制濃度為0.18 ng/mL，α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol, α-ZOL) 為0.39 ng/mL，β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol, β-ZOL)為0.46 ng/mL，玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN) 0.30 ng/mL，α-玉米赤霉醇(α-zearalanol, α-ZAL) 0.30 ng/mL，β-玉米赤霉醇(β-zearalanol, β-ZAL) 0.73 ng/mL。將該傳感器應用于篩選天然污染的玉米樣品，檢測結果與高效液相色譜-串聯質譜聯用技術結果相關性良好。

ZHAO等[37]采用生物素-親和素系統，利用鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶標記ZEN-牛血清白蛋白偶聯物作為競爭者，結合磁納米顆粒的磁分離效應，建立了納米熒光生物傳感器，并用于玉米樣品中ZEN的檢測，檢測限低至0.13 ng/mL。為了進一步提高熒光傳感器的靈敏度，HENDRICKISON等[38]利用高靈敏度的化學發光底物替代過氧化物酶標記的傳統比色底物,檢測限低至4 pg/mL，總檢測時間為25min，對紅葡萄酒和白葡萄酒中的ZEN進行檢測，檢測限分別為0.03和0.05 ng/g，該方法具有普遍性，是快速控制各種污染物的有效工具。ZHAN等[39]利用量子點無與倫比的光學特性，結合過氧化氫酶對H2O2的高催化活性和量子點對H2O2的敏感性，建立了量子點生物傳感器檢測玉米中的ZEN。該傳感器在2.4～1.25 ng/mL線性良好，檢出限為4.1 pg/mL。ZHANG等[40]結合生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統的特異性結合能力和磁性納米粒子的分離特性，建立了納米熒光生物傳感器，用于谷物和飼料樣品中ZEN的檢測。該傳感器線性范圍為0.07～2.41 ng/mL，檢測限為0.04 ng/mL，適用于在相關實驗室中快速檢測谷類和飼料樣品中的ZEN。

2 分子識別型生物傳感器

2.1 核酸適配體生物傳感器

核酸適配體生物傳感器是以ZEN適配體分子識別物質，以與ZEN的特異性作用引起的直接或間接信號變化對小麥、玉米、飼料等樣品中ZEN進行檢測的傳感器。

WANG等[41]成功篩選出ZEN的單鏈DNA,建立核酸適配體生物傳感器，對玉米樣品中的ZEN進行檢測，檢出限和半抑制濃度分別為0.01和0.2 ng/mL。WU等[42]利用上轉換納米粒子的低自發熒光背景、良好的光化學穩定性，磁性納米顆粒的磁分離效應及核酸適配體的高特異性，研發了基于納米粒子的適配體傳感器，對玉米及啤酒中的ZEN進行檢測，具有良好的回收率和檢測限。NIAZ等[43]提出了基于ZEN適配體標記的胺官能化磁性納米粒子作為捕獲探針和時間分辨熒光納米粒子標記互補DNA作為信號探針，建立核酸適配體生物傳感器，用于檢測農產品和食品中的ZEN，線性范圍為0.001～10 ng/mL，檢測限為0.21 pg/mL。TAGHDISI等[44]結合金納米顆粒與核酸外切酶III的信號放大功能，建立了比色核酸適配體傳感器，能夠在寬線性動態范圍(20～80 000 ng/L)內檢測到ZEN，檢測限為10 ng/L。

GOUD等[45]將氧化石墨烯(FGO)作為羧基熒光素(FAM)的熒光猝滅劑，修飾有FAM的ZEN適配體(FAM-aptamer)與FGO形成基態復合物導致熒光猝滅，而目標分析物ZEN出現后，由于目標物ZEN與適配體特異性結合，熒光強度恢復值與ZEN濃度呈正比，據此原理(圖3)建立了適配體傳感器用于啤酒及葡萄酒樣品中ZEN的檢測，檢測范圍為0.5～64 ng/mL，檢測限為0.5 ng/mL。

FAM-Aaptamer-羧基熒光素標記的適配體；FGO-羧基官能化的氧化石墨烯圖3 核酸適配體傳感器示意圖Fig.3 Schematic diagram of aptamer sensor

2.2 細胞傳感器

細胞傳感器是由固定或未固定的活細胞與電極或其他轉換器組合而成的一類生物傳感器。當活細胞與分子識別元件特異性結合后，產生的信息通過換能器轉換為可定量和可處理的信號，從而達到分析檢測的目的。細胞傳感器已成為生物傳感器研究領域的一大熱點。JI等[46]首次研發了人胚腎293細胞(HEK-293)熒光傳感器并用于檢測和評估由鐮刀菌產生的常見食物污染物ZEN，回收率和檢測限均較為理想，檢測限為3.2 ng/mL。細胞傳感器也常用于評價ZEN等其他真菌毒素的毒性，DU等[47]研發了一種基于細胞的電化學生物傳感器來評估DON和ZEN對BEL-7402細胞的個體和組合毒性。SUN等[48]為了更加靈敏的評估ZEN的毒性，在DU等[47]的基礎上，開發了基于細胞的電化學生物傳感器來評估DON，ZEN和AFB11在Hep G2細胞上的個體和組合毒性，與傳統的細胞毒性評價方法相比，該方法簡單，方便，靈敏，反應速度快。

3 討論與展望

生物傳感器檢測技術由于快速、靈敏、簡單經濟的優點，在ZEN污染檢測控制方面發揮重要的作用，但是根據目前的研究發現多方面需要進一步研究。

(1)信號放大技術中納米放大技術是發展較快的放大技術，依托新材料領域的高速發展，可以探索更多的納米材料應用于食品檢測領域如介孔二氧化硅納米材料，上轉換納米粒子等。

(2)酶放大技術中目前發現具有易變性、不穩定、易被破壞等特點，只應用酶放大技術存在一定局限性，而核酸適配體具有特異性強、在非生理條件下的高穩定性、低成本、易修飾等特點成為近年來研究的熱點。在酶作為放大識別過程的催化探針時，與易修飾的核酸適配體相結合，將有效提高檢測方法的靈敏度與穩定性。

(3)ZEN的代謝產物α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL、β-ZAL及ZAN通過強烈的雌激素活性而產生有害的健康效應，很多還屬于隱蔽型毒素，其結構、極性、溶解度和分子質量較母體分子發生變化，通過傳統的前處理和檢測方法常常漏檢，多通道的、可同時檢測ZEN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL、β-ZAL及ZAN等衍生物的生物傳感器檢測技術是未來還需進一步研究的方向。

(4)目前，用于檢測食品原料及飼料中ZEN的傳統方法主要是以色譜為主的精準檢測技術(高效液相色譜法、氣象色譜法等)和基于免疫技術的快檢方法(ELISA、膠體金快速測試卡法等)。傳統的依托大型精密儀器的精準檢測技術可以準確定量目標物的含量，但需設備昂貴，樣品前處理時間長及繁瑣，費用高，需要專業的操作人員，不易推廣，不適用于現場快速檢測樣品。而目前的快速檢測方法能夠達到現場快速檢測樣品的要求，但是靈敏度和準確度低，假陽性率高，不能達到準確分析檢測的目的。因此，仍然需要靈敏度及準確性高，簡便快捷，經濟，能夠達到實時分析和經濟要求的檢測方法。生物傳感器技術作為ZEN檢測的前景替代方法，具有高專一性、高選擇性、便攜性和實時分析的性能，具有可觀的發展前景。