乳品有害微生物檢測與控制研究進展

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(1.浙江工商大學,浙江杭州 310018; 2.北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

乳品中富含各種營養成分且pH呈中性,適宜有害微生物生長。其中有害微生物種類主要包括李斯特菌、蠟狀芽孢桿菌、假單胞菌、梭菌、致病性大腸桿菌、彎曲桿菌、霉菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等[1]。研究表明,乳品中有害微生物可引發食品安全問題并影響消費者健康,如假單胞菌、蠟狀芽孢桿菌等所產生的色素以及內毒素會造成食品污染以及食品腐敗等[2],李斯特菌可導致孕婦流產以及侵襲感染易感個體并導致高死亡率[3]。

據統計中國乳品產業累計產量穩步增長,2018年液態奶產量超過2500萬噸,由乳品加工銷售收入近3400億元。隨著乳品行業的快速發展和消費者需求的增加,乳品有害微生物關聯的質量安全問題引起了廣泛關注,可直接影響到乳品的食用安全和消費者的健康,成為研究的熱點。鑒于此,如何快速、準確地檢測乳品中的有害微生物以及針對性有效控制顯得尤為重要,這對推進乳品行業的可持續發展以及保障消費者的健康有著重要的現實意義,同時這也是大健康背景下乳品產業持續推進的需要。

1 乳品有害微生物檢測技術

由于乳品行業發展迅速且其中食品安全問題受到廣泛關注,因此,如何檢測能夠引起乳制品質量安全問題的有害微生物就尤為重要。下文對三種乳品中有害微生物檢測方法介紹,以期通過這些檢測技術保證乳品質量安全。

1.1 PCR技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術在乳品等食品有害微生物檢測中已有廣泛應用。胡冰雪等[4]建立了熒光假單胞菌、沙門氏菌和單增李斯特菌等有害微生物檢測的多重PCR技術。Xiao等[5]則進一步對多重PCR技術進行了研究與拓展,同時引入了高分辨率熔解分析技術,研究證實該方法能夠高效地檢測乳品中沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌,可應用于乳品中有害微生物檢測,特別是對大批量樣品檢測具有現實指導意義。除多重PCR技術之外,定量PCR因其具有快速、靈敏、可重復性高、污染小等優點,也常被作為食品中有害微生物檢測的技術[6]。Katholm等[7]利用RT-qPCR(Real-time Quantitative PCR)成功測定了乳制品中的假單胞菌、鏈球菌、腸桿菌和芽孢桿菌,為解決乳品中總細菌數高的問題提供幫助。在此之后,Ohkubo等[8]對實時PCR技術進行了改進開展了微生物孢子的定量檢測,通過借助于實時PCR與SYBR Green I結合,并利用細胞核熒光探針EMA(Ethidium monoazide)對乳品樣品中微生物Anoxybacillusflavithermus和Geobacillusstearothermophilus的孢子進行了定量測定,并在蛋白質含量較高的乳品中精確定量其孢子,該研究成果也有望于應用在乳品微生物的衛生管理中。

除PCR檢測技術外,由于傳統基因芯片技術也能進行金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的檢測[9],因此將基因芯片技術與PCR技術結合成為乳品有害微生物檢測中一類新的方法。Bae等[10]將這兩種技術結合應用于乳品中蠟狀芽孢桿菌檢測,檢測限可低至1.0×101CFU mL-1,它不僅適用于食源性有害微生物的快速和現場檢測,還具有即時檢測(Point-of-care testing,POCT)應用的巨大潛力。除了將基因芯片技術與PCR技術結合,Park等[11]開發了一種將PCR與電化學檢測結合的集成生物傳感芯片,并成功地將該芯片應用于有害微生物金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌的定量檢測。

但由于PCR技術只可檢測核酸序列已知的微生物,難以檢測未知微生物,并且其檢測結果需通過電泳等形式進行可視化,操作較為復雜,因此其在應用中仍有所局限。但借助以上所提及的PCR技術效率高、靈敏等優點,將其作為乳制品中有害微生物的初步檢測能夠縮短其檢測周期,加快對食品中有害微生物的檢測。

1.2 ELISA與磁珠分離技術

酶聯免疫吸附測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)技術因其高靈敏度、方便快速、特異性高等優點使其逐漸應用于有害微生物檢測中。Hamzehlou等[12]將ELISA與顯微鏡觀察法比較研究,結果發現ELISA對結核分枝桿菌的觀察下限高,靈敏度好,特異性強,可用于替代顯微鏡觀察法。ELISA技術在對食品中微量微生物檢測如金黃色葡萄球菌等具有高效靈敏的特點[13]。目前,Attalla等[14]運用ELISA技術,通過光密度值分析對牛奶中結核桿菌進行定量測定。在微生物檢測方面,ELISA技術具有很大的應用價值,因此ELISA技術在乳品微生物檢測中也具有極大潛力,但與此同時因ELISA技術其會受抗原間的交叉反應的干擾,且對試劑要求高等缺點導致其未能完全普及,并且由于ELISA技術的特異性導致其難以對多種組分進行同時檢測。

依賴于抗原-抗體反應的磁珠分離技術是一種具有高靈敏度和特異性并且能夠用于有害微生物的定性和定量分析,同時也無需后續的生化鑒定過程,極大地提高了研究效率的技術。Zhu等[15]利用具有良好生物學和化學性質的天然多糖-殼聚糖合成免疫磁珠,建立了將磁珠與生色介質結合的檢測方法來檢測奶粉中的坂崎腸桿菌(EnterobacterSakazakii),因其特異性和靈敏性能夠為復雜樣品中坂崎腸桿菌快速檢測提供了新的思路。楊柳等[16]利用免疫磁珠技術與熒光PCR技術相結合用于檢測牛乳中的阪崎腸桿菌,結果表明,其對阪崎腸桿菌吸附率為77.7%,證實了其特異性以及靈敏性。但免疫磁珠技術在乳制品有害微生物檢測除阪崎腸桿菌外應用不多,仍處于發展階段,主要面臨的問題有其對生物細胞活性的影響以及所提微生物純度不高等。

1.3 LAMP技術

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一種簡單、高效的有害微生物檢測技術。LAMP技術相較于PCR和實時PCR等技術而言,具有對使用者的技術要求低和樣品的檢測成本低等優勢。Zhao等[17]利用靶向沙門氏菌siiA基因開發了一種快速、特異、靈敏的LAMP-LFD(Lateral Flow Dipstick)技術用于檢測嬰兒配方奶粉中的沙門氏菌,siiA調節蛋白對于SPI4(Salmonellapathogenicityisland)編碼的I型分泌系統的功能體現是必要的[18],并且該調節蛋白可以影響沙門氏菌毒性基因的表達敏感性。

此外,根據Zhou等[19]的后續研究利用光敏反應DNA結合染料疊氮溴化丙錠(Propidium monoazide,PMA)進一步優化了檢測方法,消除了攜帶的潛在污染,使其應用更為廣闊,能夠更快檢測乳品中的大腸桿菌和沙門氏菌。目前利用LAMP技術對牛奶中支原體進行檢測,整個過程可在1 h內完成,大大縮短了檢測時間[17]。但由于LAMP技術使用系統為開放系統,所以易造成環境污染。

2 乳品有害微生物控制技術

微生物安全仍是當前乳品行業中的一個主要的問題。原料乳采集以及加工過程均存在微生物污染的風險,因此如何控制乳品中有害微生物是乳品生產過程中的關鍵。巴氏殺菌法是目前較為普及的乳品滅菌技術,同時脈沖電場技術等現代滅菌技術也具有極大的發展應用潛力。

2.1 原料中有害微生物控制技術

在原料奶的生產和驗收過程中,由于產奶動物相關疾病的感染可造成有害微生物等污染,其中因乳腺炎引起的二次污染最具有代表性。乳鏈球菌、金黃葡萄球菌、大腸桿菌、化膿性棒狀桿菌等細菌及一些真菌類和病毒均可以引起這類感染,感染后能以亞臨床無明顯的感染跡象形式存在或者以臨床/慢性有明顯感染跡象形式存在。針對這類問題,Ruegg等[20]在研究中發現通過采用適當的擠奶設備和規范的操作流程可以顯著降低二次污染,借助于原料奶中的體細胞數計數檢測(Somatic Cell Count,SCC),以及動物乳頭浸漬和抗生素治療等措施,可以最大限度地減少乳腺炎的發病率及二次感染率。但是,在抗生素的應用方面,不建議不加區別地濫用抗生素,以免通過原料奶直接對消費者構成健康威脅和帶來環境的二次污染。

2.2 加工過程中有害微生物控制技術

2.2.1 超高壓滅菌技術 超高壓處理(Ultra-high-pressure Processing,UHP)簡稱高壓技術(High-pressure Processing,HPP),目前廣泛應用在食品中微生物的控制,可以有效控制絕大部分的細菌、酵母菌和霉菌。在研究UHP技術作為標準原料乳加工方法的過程中,Barbosa-Cnovas等[21]檢測了不同壓力水平(400～600 MPa)和暴露時間(1～5 min)對于接種于原料乳中的致病性大腸桿菌,沙門氏菌和單核增生李斯特菌的作用效果,發現高壓處理技術可有效地使致病菌濃度降低5lg(CFU/mL)以上,隨后在能最有效控制致病菌的UHP條件下探究了該技術對冷藏期間乳品保質期、顆粒大小和色澤等的影響。與巴氏殺菌乳和生乳相比,UHP(600 MPa,3 min)顯著降低了乳品中總活菌數及腸桿菌科和假單胞菌屬等,延長了乳品1周左右的保質期。此外經UHP處理的乳品與巴氏殺菌乳相比較好的保留了原始未加工牛奶的粒度和色澤等品質屬性。

盡管從技術本身UHP有發展成為乳品行業微生物控制的主流技術的可能,但是Alegbeleye等[22]認為此類技術仍存在一些問題,這些問題限制了其在乳品加工中的全面應用。這些問題即限制性因素除了無法控制微生物孢子之外,還有兩個最主要因素。一是需要優化加工模式以確保乳品的全面生產;二是有研究證明UHP等技術可以使天然乳蛋白變性。近期的一項研究評估了UHP方法牛奶蛋白質的影響和免疫原性改變情況[23]。研究結果表明UHP處理會引起乳清蛋白(主要是β乳球蛋白和免疫球蛋白G)的變性從而導致蛋白質聚集和酪蛋白膠束結構扭曲。由此可見,UHP的全面應用仍需要進一步深入研究。

2.2.2 超高壓均質化技術 超高壓均質化(Ultra-high-pressure homogenization,UHPH)是一種依賴超高動態壓力的新興技術。高壓、溫度、剪切、空化和沖擊的組合優化處理能提供更高質量和更長保質期的商業無菌乳品[24]。與高壓均質通常使用的100～200 MPa壓力不同,UHPH使用高于200 MPa的壓力。Sharabi等[25]的研究表明UHPH能夠顯著降低乳品總菌數,而對于影響乳品的營養和感官特性并不顯著,特別是對乳品的抗氧化能力沒有影響,這是巴氏殺菌技術所不具備的技術優勢。UHPH基于短時間內溫度升高和均質化過程中產生的機械力使微生物失活,期間溫度的峰值通常會持續很短的時間,根據Zamora等[26]的報告這個時間不超過1 s。這種溫度上升雖然很短暫,但卻對微生物的滅活有著顯著的效果,并且在一定程度上將熱處理對乳品的負面影響最小化,可有效提高乳品穩定性、延長乳品保質期。

雖然UHPH技術在乳品殺菌方面顯示出巨大的潛力,且對乳品感官特性沒有顯著改變,但是Briviba等[27]研究表明,UHPH會在乳品中引起一些物理化學修飾,如包括部分酶的失活、蛋白質結構改變、脂肪球變小以及表面蛋白的修飾等。此外,研究表明150～450 MPa壓力條件下處理15 min,會引起重構的膠束酪蛋白濃縮物和乳蛋白濃縮物發生顯著變化[28]。

2.2.3 脈沖電場技術 脈沖電場技術(Pulsed Electric Fields,PEF)是一種基于高場強下對食品產生的極短脈沖的連續過程,由于PEF技術可以提高產品質量和穩定性,同時不影響產品和工藝安全,近年來受到廣泛關注并作為熱巴氏殺菌可能的替代技術得以深入研究。PEF技術能夠控制大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌、蠟狀芽孢桿菌及乳品中絕大部分有害微生物[29]。研究發現,在15 ℃下使用PEF處理能夠使脫脂乳中的大腸桿菌失活,其中脈沖持續時間的增加會改善大腸桿菌的滅活效果,與未處理的原料乳相比,在30 kV/cm和53 ℃出口溫度下PEF處理22 μs可以使乳品保質期在4 ℃下延長約3～4 d,效果類似于63 ℃的溫和熱化處理15 s[30]。同時,PEF可以減少傳統熱處理對乳品感官和理化性質的不利影響,與常規熱處理相比,PEF對乳品中的乳鐵蛋白更溫和,可以更好地保護其結構和活性[31]。而且相對較低的加工溫度和微秒停留時間可促進乳制品質量和營養成分的保留。如在35 kV/cm,70 ℃條件下(天然pH)PEF處理重組脫脂乳19 μs,并不會影響乳酪蛋白或乳清蛋白的物理化學性質。

近期相關研究中發現PEF處理改變了復原脫脂乳的流動行為和粘度[32],而且PEF的作用效果通常取決于電場強度、脈沖強度、脈沖數以及脈沖形狀等較多參數,針對不同來源和配方的乳品,PEF技術處理條件如最佳脈沖、溫度和處理時間等也均需要進一步探究。

2.2.4 微濾技術 微濾是一種低壓驅動的膜過濾工藝,該技術主要依賴于膜作用,借助于優化設計使需要的組分通過,同時抑制大多數不需要的組分,從而將包括微生物和孢子的顆粒物質與乳品分離,該技術已成功應用于乳品的冷巴氏殺菌、乳品及乳清中脂肪去除等領域。Mukhopadhyay等[33]認為使用微濾技術物理去除細菌和孢子,可避免熱巴氏滅菌及高溫高壓處理帶來的最終乳品產品各種質量問題,其中包括乳品中蛋白質聚集變性、氨基酸損失、風味色澤改變等。如果在巴氏滅菌之前的過程中進行微濾,就能夠在不改變乳品營養屬性的前提下達到顯著延長乳品保質期的目的。有研究表明使用孔徑為0.5 μm的微濾膜,100 ℃熱處理2 s,能夠在室溫下生產可穩定保存6～9個月的乳品[34]。另外,微濾技術的使用顯著降低了常規添加劑添加的需要,從而可實現不含額外添加劑的干酪和乳清的生產。

2.2.5 柵欄技術 柵欄技術(Hurdle technology,HT)是將具有殺菌潛力的方法和技術整合并優化以獲得更加安全、更加被公眾接受的產品,這一技術引起了廣泛關注并成為研究的熱點。柵欄技術涉及到多種同步處理方法,將非熱食品加工與傳統或其他新興技術融合在一起,同時基于各種機制抑制或滅活目標有害微生物。這種技術在有害微生物控制方面顯示出令人滿意的效果同時對食品質量的影響甚微[35]。Evelyn等[36]的研究模擬高壓處理與熱處理的組合控制乳品中的嗜冷芽孢桿菌,并將結果與僅進行熱處理的乳品進行比較。結果表明高壓技術進一步增強了熱處理控制乳品中蠟狀芽孢桿菌孢子的能力。柵欄技術的成功應用包括將微濾技術與超高溫處理的組合以控制生脫脂乳中的微生物等,研究證明了微濾技術顯著增加了超高溫瞬時滅菌處理的乳的儲存穩定性[37]。此外,Chugh等[38]采用微濾技術與脈沖電場的組合對原料乳進行加工,處理后的乳品中未觀察到脫脂乳的感官品質有顯著變化,將該處理所得的產品與僅用微濾處理的樣品進行了比較,在后者中觀察到明顯的產品色澤變化。可見柵欄技術的有效組合策略能夠在保持乳品的感官特性的同時確保乳品的微生物安全性。無論何種組合,經過優化和選擇,加工的最終目標都是消除有害微生物的威脅和延長乳品保存時間。目前的研究已經逐步在探索了食品工業中使用柵欄技術的各種組合策略。但是,結合乳品產品的多樣性和復雜性,仍需要進一步開展有效的工作以建立在乳品領域不同處理的適當組合策略,確保乳品的整體性質和消費者的食用安全。

3 展望

研究發現,在乳品的生產加工中有許多潛在有害微生物污染,包括動物養殖、加工環境以及相關設備等。盡管人們在相關領域已經取得了顯著的進步,但乳品生產過程中的有害微生物控制仍無法得到全面保證。除了原料乳污染外,目前加工過程中微生物的殘留等可能性因素也會導致乳品的安全隱患。事實證明原料乳中的有害微生物可以在乳品冷藏儲存中及巴氏殺菌溫度下存活,進一步驗證了對乳品加工操作和乳品生產環境進行嚴格控制的必要性。目前的乳品工業生產系統仍然存在著安全漏洞,應該加以研究和解決。因此借助于新興技術的發展和檢測手段的提升,加強乳品生產中有害微生物檢測監控和控制,強化乳品加工中的有效殺菌技術,具有重要的現實意義。