哈維氏弧菌致病因子檢測與防治研究進展

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(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

近年來,水產品多為集約型養殖,使得養殖水域范圍內水質極易惡化,水產品頻繁爆發大規模的弧菌疾病。哈維氏弧菌作為其中一種主要致病弧菌,曾引起大量養殖水產品染病甚至死亡[1-5]。哈維氏弧菌為發光的革蘭氏陰性弧菌,呈短桿狀,長約1～2 μm,極端單鞭毛,可運動,最適宜生長溫度為20～35 ℃。在TCBS培養基上培養形成圓形黃色菌落,邊緣整齊,直徑約為1～1.5 mm[6]。哈維氏弧菌有一定嗜鹽性,可以利用葡萄糖,對O/129敏感。對環丙沙星、氯霉素、恩諾沙星、美羅培南、頭孢曲松、多西環素、頭孢吡肟、諾氟沙星敏感,而對氨芐西林耐受性強[7]。目前關于弧菌的檢測多用免疫學檢測方法如免疫層析技術[8],酶聯免疫技術(ELISA)[9-10],免疫印記技術[9-11]以及與分子生物學方法PCR[12]及LAMP[13-15]法等。由于對其致病機制的研究尚未成熟,目前所了解的與哈維式弧菌致病性的相關因素主要有弧菌本身分泌的胞外產物(ECP)如胞外蛋白酶,溶血素[16]、細胞毒素、鐵載體等,除此之外,還有菌群密度感應系統(QS)，也是哈維氏弧菌致病性影響因素之一[17]。并且由于長期使用抗生素類藥物抑制弧菌疾病,易導致病原哈維氏弧菌產生耐藥性,故現下不適宜用抗生素藥物進行抑制,新的抑制弧菌疾病的方法亟待開發。本文對哈維氏弧菌的致病因素、檢測技術以及防治研究做一綜述,以期為找到診斷及預防該弧菌疾病的技術提供有力幫助[16-17]。

1 哈維氏弧菌致病因素

細菌生長代謝過程種所產生的胞外產物(ECP)對宿主存在極大的毒性作用。胞外產物中主要的致病因子有胞外蛋白酶,溶血素(vhh),鐵載體等[18]。

1.1 胞外產物蛋白酶(ECPase)

胞外產物蛋白酶(ECPase)作為哈維氏弧菌胞外產物中的主要毒力因子,表現出很高的絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性,且有明顯的菌株特異性。哈維氏弧菌通過其自身分泌的胞外酶來干擾宿主機體的平衡,從而引起病原菌在宿主體內繁殖,并隨血淋巴運動到宿主全身,破壞宿主的凝血系統酶活性,造成血細胞溶解,最終致使宿主石斑魚身體潰爛而死亡[19]。因此研究人員可以通過研究控制絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等酶活的相關方法來達到抑制哈維氏弧菌胞外蛋白酶活性,從而抑制弧菌疾病的目的。

1.2 溶血素

溶血素作為主要的致病因子,在致病性弧菌中分布較廣泛[20]。其通過自身的磷脂酶活性作用于宿主紅細胞膜的磷脂雙分子層,使宿主紅細胞膜破裂溶解,血紅蛋白以及其它內物質大量溢出,造成細胞溶血。弧菌的溶血素基因多屬于TLH和HLX 溶血素基因家族[21],所以具有兩個TLH基因的哈維氏弧菌致病能力較強。

1.3 鐵載體

鐵是微生物生長必不可少的元素,為了維持正常生長,微生物自身便形成了高效的鐵獲取系統,最常見的是鐵載體[22]。鐵載體是微生物分泌到胞外的一種可以結合鐵離子并將其提供給微生物細胞的離子載體,Kyoungmi等[23]發現其研究的五株哈維氏弧菌的胞外產物中均檢測出含有鐵載體。與上述兩種致病因子不同,鐵載體是在當宿主的紅細胞受損時,螯合暴露出來的含鐵蛋白(血紅蛋白、鐵傳遞蛋白和乳鐵傳遞蛋白等),運回病原菌細胞內供其生長繁殖,并造成宿主細胞的鐵匱,從而引起宿主的疾病。因此減少水產品的機械損傷，可以控制其因鐵載體引起的哈維氏弧菌疾病。

1.4 其他

除了上述幾種因素,菌群的密度感應系統、細菌對宿主體內血清的抗性作用以及環境因素也會引起宿主疾病。

1.4.1 密度感應(QS) 密度感應(QS)是基于小信號分子的細胞間通信系統,QS信號的濃度隨著環境中細菌數量的增加而逐漸上漲,在達到閾值濃度時,信號分子激活特異性受體以調節QS依賴性基因表達[24]。已有結果表明哈維氏弧菌的三種密度感應系統都有其相對應的自我誘導分子控制自身的生物發光、鐵載體、蛋白酶、III型分泌系統、生物被膜的基因的表達[12,25],控制弧菌的致病性。群體密度作為一種控制弧菌疾病的因素,可以根據控制水產品的畝產以及幼苗的投放量并及時發現與移除患病水產品,盡最大可能減少弧菌菌群密度,從而控制弧菌疾病。

1.4.2 血清抗性 細菌感染宿主后,進入宿主血液,會受到宿主血液中的溶菌素、補體等的清除作用。而細菌對于宿主血清的抵抗能力直接關系到其對宿主的致病能力[26]。某些哈維氏弧菌菌株在宿主血清中表現出高存活率,可能是因為其可以抵抗宿主血清的清除作用,從而引起宿主細胞的免疫能力下降而致病。Li等[27]的研究發現哈維氏弧菌能夠抵抗宿主血清的清除作用并在宿主細胞內形成凋亡小體引起宿主細胞的凋亡壞死,從而達到其致病的效果。細菌對于宿主血清的抗性作用加強了其對宿主的致病能力。

1.4.3 環境因素 Zha等[28]研究了海水酸化可能會導致血蛤及其病原體哈維氏弧菌的病原體-宿主相互作用發生改變,并使宿主更容易受到細菌感染,故養殖水體環境的非正常改變或者惡化會引起水產品的患病率的上升。還有研究發現,環境因素如pH、溫度、氨氮硝酸氮的濃度對哈維氏弧菌的致病性存在影響,其中溫度為主要的影響因子[29-30]。

2 哈維氏弧菌的快速檢測技術

由于哈維氏弧菌復雜的生理生化及遺傳特性,傳統的生理生化檢測哈維氏弧菌耗時長且效率不高,為縮短檢測時間,節省人力物力,如今正逐漸傾向于發展哈維氏弧菌的快速檢測方法。

2.1 分子生物學技術

2.1.1 PCR檢測技術 近年來,PCR檢測技術因其較強的特異性以及靈敏性被廣泛用于水產品中各種弧菌疾病以及病毒的檢測,可以根據某一弧菌的特定基因來建立特異性檢測該弧菌的鑒定方法。廖梅杰等[31]以哈維氏弧菌特異性溶血素基因vhhP2為基礎,設定該溶血素基因為靶基因,創建了可以特異性檢測哈維氏弧菌的引物。現如今有研究人員通過建立多重引物,對病原菌進行同步PCR檢測已取得不錯的效果。耿偉光等[32]利用同時設計多種病原菌引物的方法,對患病水產品體內分離出的多種病原菌進行同步檢測。檢測結果特異性強,且與其他細菌以及宿主無交叉反應。Ana等[33]同樣根據三種編碼蛋白質基因(opA,ftsZ和mreB)來設計具有種特異性的引物用于區分哈維氏弧菌、輪蟲弧菌、坎貝利弧菌等幾種近緣弧菌。有研究者建立了快速實時定量PCR鑒定哈維氏弧菌和pVCR1質粒的DNA并對其定量[34],關于哈維氏弧菌的檢測,除了上述編碼蛋白質的相關基因以及特異性的溶血素基因,還可以利用其基因組中的其他基因如16Sr DNA以及DNA 拓撲異構酶B亞基(gyr B)一以及其它毒力基因等進行PCR 擴增,后將擴增的產物進行序列對比即可得出測定結果。

2.1.2 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術(LAMP)是較PCR分析更為快速的分析檢測技術,Cao[35]以及張靜等[36]根據哈維氏弧菌tOxR基因上一段保守序列設計出一套LAMP引物進行特異性擴增,實驗結果均是除哈維氏弧菌以外,其他的實驗弧菌以及細菌均未能擴增出該基因的片段,該方法可以用于特異性檢測哈維氏弧菌。Yu等[37]設計的三重LAMP法通過設計三組不同的特異性引物來鑒定三種主要的魚類致病性弧菌哈維氏弧菌,鰻弧菌和溶藻弧菌,靈敏度是傳統PCR分析的102～103倍,是一種能夠快速且靈敏度較高的魚體內弧菌的檢測技術。程碟等[38]也利用溶血素基因為檢測靶標,建立了LAMP-LED的方法,可以更加清楚方便的檢測哈維氏弧菌。與PCR技術一樣,LAMP法較普通檢測方法提高了檢測效率。但是相比于PCR技術,LAMP法增加了引物的量,具有較好的特異性,并且在恒溫擴增減少了擴增階段繁瑣的溫度循環,降低了對儀器的要求,縮短了檢測時間,降低了檢測成本;擴增產物可以直接由肉眼觀察檢測,無需借助儀器檢測。但是該方法還存在擴增體系易污染且防疫體系較為復雜等問題亟待解決。

2.2 免疫診斷技術

免疫學方法相比其他檢測技術,具有較強特異性,高靈敏性并且易于觀察等特點。酶聯免疫(ELISA)技術是免疫診斷技術中應用最為廣泛的一種,是檢測免疫反應產物生成以及產物的顏色來進行定性及定量。早前,Robertson[39]就曾利用ELISA法檢測過水體中以及對蝦體內的哈維氏弧菌。Kumar[40]等人根據溶血素基因設計了單克隆抗體,采用單克隆夾心ELISA法來檢驗海產品中副溶血弧菌。較其他克隆方法,該方法更為靈敏,可以將其利用在哈維氏弧菌的檢測上。

3 哈維氏弧菌疾病的防治

弧菌是海洋生物以及養殖水產品中的正常菌群,在一定的范圍內,不會引起病害,若是弧菌密度急劇增大引起水產品疾病,嚴重則會導致死亡。目前多使用抗生素抑制病原哈維氏弧菌病害。但是長期使用會引起菌群的耐藥性且對身體造成很大的傷害。所以,有效抑制哈維氏弧菌的方法以及新型的無毒害弧菌抑制劑的研究是十分必要的。溫度作為影響哈維氏弧菌的致病性的影響因子,通過控制養殖水體溫度來達到抑制哈維氏弧菌活性,從而減少弧菌疾病是一個很好的研究方向。有機酸作為抗生素替代添加劑現正在逐漸受到人們的關注,研究用新型微膠囊化有機酸混合物喂養池塘養殖虎蝦,發現對于哈維氏弧菌的感染,喂養過后的虎蝦有增強免疫的作用,說明有機酸是一種良好的抗生素替代劑[41]。大蒜的提取物也曾被用于研究抑制哈維氏弧菌的活性[42],新鮮的大蒜提取物對于哈維氏弧菌活性的抑制作用為最優。還可以通過多輪菌株毒性實驗對養殖水產品進行抗菌體的篩育,Huang等[43]通過對凡納濱對蝦的三輪抗菌體篩選實驗,選育出了哈維氏弧菌顯著的抗菌體。有研究通過使用群體感應干擾化合物保護巨型淡水蝦羅氏沼蝦的幼蟲免受哈維氏弧菌感染[44],發現該方法不會對幼蝦的生長產生負面的影響,但是該方法還需要進一步發展與完善。以上抑制哈維氏弧菌活性以及疾病的方法均是綠色、安全、衛生的,替代抗生素的作用,避免了水產品中的藥物殘留威脅到人類身體健康。

4 展望

由于哈維氏弧菌復雜的生理生化特性,研究人員對于其致病特性一直在不斷的摸索當中。目前,我們對于哈維氏弧菌的檢測多在于定性方面,但對其致病性及其致病能力的強弱檢測方法則無相關報道。因此對于哈維氏弧菌的致病性以及致病能力強弱的研究是現在所迫切需要的。代謝組學技術通過對生物體或細胞代謝產生的物質進行定性定量分析可以很好的利用到哈維氏弧菌的檢測當中。目前代謝組學技術主要有氣相色譜-質譜聯用技術、液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS)以及核磁共振波譜技術(NMR)等。Liu等[45]利用核磁共振技術比較了鰻弧菌和燦爛弧菌對蛤蜊肝胰腺的誘導代謝反應,發現鰻弧菌在蛤蜊肝胰臟中引起的氧化和免疫應激比輝綠弧菌更嚴重,他們還利用核磁共振技術驗證了哈氏弧菌對貽貝的影響主要體現在貽貝體內葡萄糖合成以及ATP/AMP轉化途徑中誘導滲透破壞并減少能量需求,可以通過參與能量代謝和磷酸膽堿含量所顯示[46]。因此作者猜測研究人員可以通過代謝組學技術檢測被弧菌感染的水產品,根據其體內免疫應激反應強弱以及能量變化的情況來檢測哈維氏弧菌對于宿主的致病強弱。因此預測采用基于代謝組學技術的檢測方法可以通過獲取哈維氏弧菌侵染宿主后發生的代謝信息的變化,推測出哈維氏弧菌的致病能力,從而建立高速有效的鑒定哈維氏弧菌的致病能力的方法。