γ-谷氨酰轉肽酶基因工程菌的研究進展

胡永彬，徐禮生，孫 玥，于巧玲

(1.新宇藥業股份有限公司，安徽 宿州 234000；2.宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyltrainspeptidase,EC2.3.2.2)是一種參與谷氨酰循環的特異性酶。不同生物中的存在位置不同，并且具有一定的特異性。在細菌中γ-谷氨酰轉肽酶存在于周質空間或是分泌到胞外環境中[2]；哺乳動物細胞內，γ-谷氨酰轉肽酶附著在血漿膜的外表面[3]；在植物細胞中，γ-谷氨酰轉肽酶是異源二聚體酶位于非原質體[4-5]。γ-谷氨酰轉肽酶是蛋白前體自主催化分裂成的一個大亞基(～40KDa)和一個小亞基(～20KDa)組成[6]，同時大小亞基相結合的轉肽活力大大高于各自的轉肽活力[7]。γ-谷氨酰轉肽酶可催化谷胱甘肽，使其的γ-谷氨酰基斷裂，轉移至相應的受體分子上[8]，該催化反應有著特異性位點強、不消耗能量等優點，因此在催化合成中有著普遍的應用。目前，利用γ-谷氨酰轉肽酶催化已經成功生產了γ-谷氨酰-L-多巴[9]、谷胱甘肽[10]、茶氨酸[11]、γ-谷氨酰-L-牛磺酸[12]、γ-谷氨酰-D-色氨酸[13-14]、γ-谷氨酰-半胱氨酸[15]等。γ-谷氨酰轉肽酶固定化不僅提高了pH穩定性和熱穩定性，也提高了對產物親和力[16-19]。同時，γ-谷氨酰轉肽酶在臨床疾病診斷、食品工業、催化合成藥物或藥物前體、改變一些物質的溶解度和穩定性等方面也都起到了重要的作用。

1 γ-谷氨酰轉肽酶的性質

γ-谷氨酰轉肽酶是單獨的大亞基(～40KDa)和小亞基(～20KDa)組成的異源二聚體[20-22]。盡管γ-谷氨酰轉肽酶的產生部位不同，但其反應原理和特異性催化是類似的。經過相關酶學知識的探究中，Alton Meiste[23]和相關研究人員表明γ-谷氨酰轉肽酶對γ-谷氨酰化合物有催化作用。當γ-谷氨酰轉肽酶催化合成γ-谷氨酰基化合物時，轉肽反應較化學法來說，有顯著的優勢，對谷氨酸無需基采用基團的保護與脫保護；催化反應時不會產生消旋體；不需要ATP提供能量；在胞外反應，過程不受細胞質的影響。盡管γ-谷氨酰轉肽酶在反應過程中受pH影響較大，如pH值6～8時一般為水解反應，轉肽反應在發生在pH值8～9。但是在微生物酶催化合成γ-谷氨酰基化合物仍有其優勢，該酶在pH大于9.0時依然存在活性，同時還能成功阻止水解反應。來自不同生物體的γ-谷氨酰轉肽酶對溫度的耐熱程度也不相同。于原核生物體內，當過高的溫度時γ-谷氨酰轉肽酶沒有活性，如B.subtilis NX-2的γ-谷氨酰轉肽酶，在溫度為60℃的情況下，酶快要完全失去活性。于真核生物內，家蠶γ-谷氨酰轉肽酶依次保存在50℃水浴中，經過2小時酶活力依然達到正常的91%[24]。

2 γ-谷氨酰轉肽酶的作用機理

γ-谷氨酰轉肽酶是是生物體內關鍵酶[25]。γ-谷氨酰轉肽酶利用不同的氨基酸(或肽類)提供γ-谷氨酰基的受體[26]。γ-谷氨酰轉肽酶的底物結構決定了其催化活性，含有γ-谷氨酰基結構的底物先與γ-谷氨酰轉肽酶蘇氨酸(第391位)位點的羥基進行轉酯化作用，生成中間產物谷氨酰基γ-谷氨酰轉肽酶，使底物暴露其氨基[27]。γ-谷氨酰轉肽酶基因是多個啟動子和多個RNA轉錄子序列，其產物蛋白相同，這可能與組織特異性和該酶的進化有關[28]。大腸桿菌k-12菌株γ-谷氨酰轉肽酶由SUZUKIH等人發現，其成熟過程發生于周質空間[29-32]。

3 γ-谷氨酰轉肽酶固定化

固定化酶是指在特定載體或區域上進行固定酶[33]。酶的固定化是在蛋白質固定化的前提下發展而來的。可通過吸附、離子交換、交聯、包埋、共價連接物等方法進行酶固定化。酶經過固定化，不僅可以保持酶的活力避免游離酶的存在的不足，從而使酶分子的結構更加穩定；還將其與反應物分離，使得生產過程得到控制；同時，經過固定化后的酶既有較高的產率、又能夠被多次使用。在現代生物技術和與之相關的工業化環節中，酶的固定化是一項重要的核心技術。20世紀50年代酶固定化技術開始得到研究，到20世紀60年代后期該項技術急速發展。1970年，我國固定化酶的相關研究也相繼展開，首當其沖的是微生物所和上海生化所。緊接著，各個研究單位也都開始著手于固定化酶和固定化細胞的應用研究[34]。近年來，γ-谷氨酰轉肽酶的固定化也有了很多的研究成果。重組枯草芽孢桿菌中，γ-谷氨酰轉肽酶采用硅烷化改性介孔氧化鈦晶須、介孔氧化鈦晶須等進行固定，提高了固定化酶耐受性[35-38]。

4 γ-谷氨酰轉肽酶的應用

γ-谷氨酰轉肽酶在微生物、植物及動物體內普遍存在。來自不同生物體的γ-谷氨酰轉肽酶，催化特性卻是相似的。γ-谷氨酰轉肽酶只特異性催化含γ-谷氨酰的化合物，對生物體內氨基酸的轉運有著關鍵的作用。γ-谷氨酰轉肽酶在臨床醫學診斷上有重要作用，γ-谷氨酰轉肽酶是谷胱甘肽代謝過程的關鍵酶，可特異性催化γ-谷氨酰基的轉移反應，在臨床上被用來標志肝膽疾病，在肝病和某些臟器疾病的診斷及預后檢測中起到顯著的作用。如血清γ-谷氨酰轉肽酶的含量可以分析肝臟炎癥的程度，γ-谷氨酰轉肽酶與HbsAg定量檢測，以評估兩者比值來診斷慢性乙型肝炎病人的肝纖維化程度[39]；監測心血管疾病和心臟病等病癥的發生[40-42]；血清γ-谷氨酰轉肽酶水平與反應胰島素抵抗的指標HOMA-C呈正相關，因此γ-谷氨酰轉肽酶經過氧化應激機制在糖尿病的發病機制以及臨床進展中也意義重大[43]。

γ-谷氨酰轉肽酶在催化產生氨基酸衍生物時有關鍵的作用，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和基因工程菌中含有γ-谷氨酰轉肽酶，利用微生物發酵法獲得該酶，方法簡單、產量較高，通過"γ-谷氨酰基化"反應合成了谷胱甘肽、茶氨酸、谷氨酰甲胺等，是γ-谷氨酰轉肽酶在生物催化工業生產的優良體現。γ-谷氨酰轉肽酶在催化合成藥物或藥物前體有著重要的作用：利用γ-谷氨酰轉肽酶高產菌Bacillus subtilis NX-2發酵產酶得到的γ-D-谷氨酰-L-色氨酸，是一種新型的廣譜免疫調節類化合物，可以有效地治療在肺結核病；運用γ-谷氨酰轉肽酶的水解活性，催化合成的7-氨基頭孢烷酸是生產頭孢菌素的重要原料。此外，γ-谷氨酰轉肽酶在改善某些氨基酸的苦味也有著重要的作用，利用-谷氨酰轉肽酶合成的苯丙氨酸形成的γ-谷氨酰-苯丙氨酸產生了與檸檬相似的鮮爽酸味，改善了氨基酸的苦味。隨著研究的不斷深入，利用γ-谷氨酰轉肽酶基因工程菌，控制單因素發酵來優化其培養基成分、反應的最適溫度、最適pH、金屬離子的促進作用，以增加大腸桿菌谷氨酰轉肽酶基因工程菌的產量，使得γ-谷氨酰轉肽酶的產量擴大，廣泛應用到臨床診斷、食品工業、催化合成藥物或藥物前體等方面[44]。

5 展望

γ-谷氨酰轉肽酶不僅是生物體內一種重要的關鍵酶，同時γ-谷氨酰轉肽酶作為基因工程菌能高效的催化生成谷胱甘肽、茶氨酸等氨基酸，使其在臨床診斷、食品工業、催化合成藥物或藥物前體等方面起到重要作用，并且通過吸附、離子交換、交聯、包埋、共價連接物等方法去實現固定化，提高了酶分子結構的穩定性和氨基酸的產量。隨著對γ-谷氨酰胺轉肽酶的研究不斷深入，γ-谷氨酰轉肽酶在工業應用中具有一定價值。