氧化石墨烯作為藥物載體的研究進展

胡玉婷，李培源

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001)

英國曼徹斯特大學Andre Germ等人的研究團隊通過簡易的機械剝離法初次獲得了具有二維晶體構造的單層六元環(huán)石墨烯(graphene)。石墨烯具有獨特且優(yōu)異的光學、力學、電學性能[1]及特殊的含氧結構，使其在能源材料、導體材料、電子設備等領域有著廣泛的應用，但石墨烯也存在著親水性差等缺點，限制了其在某些領域上的發(fā)展。在眾多學者的不斷探索下，發(fā)現(xiàn)了石墨烯的衍生物氧化石墨烯(graphene oxide，GO)，氧化石墨烯具有親水性強、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)異的特性，若對其進行功能化地修飾，可以達到高效載藥的目的，使其在生物醫(yī)學領域上有進一步的發(fā)展。

1 氧化石墨烯的性質

1.1 石墨烯的性質

石墨烯中的碳原子雜化軌道為 sp2，是具有六元環(huán)狀的二維碳基納米材料[2]，厚度僅有0.335 nm，在二維材料中是最薄的，石墨烯可以通過機械剝離法、化學合成法、化學氣相沉淀法制備，這些方法各具優(yōu)劣，故在制備方法上，有待進一步地改善。石墨烯具備穩(wěn)定的化學性質及催化作用，獨特的二維結構使其復合材料在催化、電池、傳感器等領域表現(xiàn)出優(yōu)良的性能，是極佳的電極修飾材料[3]。但其強疏水性限制了醫(yī)藥領域方面的應用，需對其進行改性或者一些化合物的接枝來進一步擴展應用范圍。

1.2 氧化石墨烯的性質

氧化石墨烯是石墨烯的含氧衍生物，故在某方面與石墨烯相似，比如碳原子結構同為層狀平面二維，而差異則在于GO表面含有羥基、羧基、羰基等豐富的含氧基團，故厚度大于石墨烯。氧化石墨烯具有兩親性，中間片層(環(huán)氧基、羥基)呈疏水性，邊緣(羧基、羰基)呈親水性，前者可通過π-π堆積或疏水作用負載一些疏水性物質，后者可以為其功能化修飾提供位點，容易對其進行表面修飾，為與其他基團的結合提供了可能，令其進一步作為載體在體內更好地發(fā)揮作用提供了基礎。GO因含有較多含氧基團故層與層之間通常帶負電荷，易與帶正電的基團相結合，使片層間距增大。關于氧化石墨烯的制取方法目前有Brodie法[4]、Staudenmaier法[5]、Hummers法[6]三種較為大眾認可。Brodie法制備效率低，且工序復雜、對環(huán)境污染較大,Staudenmaier法制備出的GO含氧量較前者提高但制備的效率依舊太低，而Hummers法是一種簡單高效的制備方法，通過大量科研人員對Hummers法進行改良，使此法成為當今較為普遍的制備GO的方法。

2 氧化石墨烯的功能化修飾

氧化石墨烯表面具有豐富的含氧基團，可通過疏水作用、氫鍵等作用吸附藥物和其他大分子[7]。這使得其在生物醫(yī)學領域具有廣泛的應用，GO在體內的血液相容性和分散性可以通過改變其尺寸或性質得到優(yōu)化，經過修飾的GO可以擁有較低的毒性，良好的靶向性和緩釋性，易通過代謝排出，縮減對正常組織代謝的不良反應，從而減少對有效物質的浪費。目前修飾方法大多分為共價修飾和非共價修飾兩種類型。

2.1 GO的共價修飾

GO的共價修飾多應用其表面豐富的含氧基團，與多種親水性較強的分子通過共價鍵接枝完成功能化修飾，目前多用殼聚糖(CS)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺(PEI)與GO表面的含氧官能團進行反應，可以使GO的穩(wěn)定性及生物相容性得到進一步提升。馬文石等[8]在溫和條件下將乙醇胺與GO進行反應，經水合肼還原，經反應形成酯鍵和酰胺鍵從而獲得乙醇胺化的氧化石墨烯，干燥后再由超聲處理，產物能穩(wěn)定分散于水、乙醇等溶劑中，乙醇胺的加入使GO在介質中的再分散性升高。孫彤等[9]制備羧基化的GO，用PEG- NH2對GO進行修飾，通過化學物理表征，證實GO-CONH-PEG在水、機體環(huán)境中可以穩(wěn)定存在，且細胞毒性小。GO的共價修飾是通過化學反應實現(xiàn)的，但化學反應的程度難以得到控制，對GO的修飾及應用產生了阻礙。對成功的案例分析可以發(fā)現(xiàn)試劑和官能團活性的差異使發(fā)生化學反應的程度不同，不同的官能團應選擇不同的試劑對其進行修飾，GO表面的環(huán)氧基易于親核試劑發(fā)生取代反應而開環(huán)[10]。石墨烯邊緣的羧基反應活性較高，故多以此基團用于改性，除此之外，環(huán)氧基和羥基也可以用于修飾。Wang等[11]人將丙基胺接枝到GO表面，大大增加了GO的水溶性和穩(wěn)定性。Shan等[12]人在GO表面連接賴氨酸(PLL)，使GO擁有更多優(yōu)異的功能。

2.2 GO的非共價修飾

關于GO的非共價修飾，更多的是利用GO層間與分子化合物之間的非共價作用力，例如π-π堆積、氫鍵、范德華力等對化合物進行物理吸附。此方法不僅保持了GO的結構穩(wěn)定，還避免了對含氧基團的改性，故在某些應用方面非共價修飾更占優(yōu)勢。GO的非共價修飾法主要包括包裹聚合物、吸附生物大分子化合物等，比如蛋白質、DNA等，均可以提高GO的穩(wěn)定性，減少細胞毒性，提高安全性[13]。崔欣等[14]利用疏水性質以及π-π堆積在GO表面連接DNA適配體，構建了GO的碳點標記DNA適配體Hg+生物傳感器。雖然非共價修飾能為GO提供一些新的特性，但此修飾方法不夠穩(wěn)定，外界的改變對其影響頗大，故對此修飾方法的改性有待進一步探索。

2.3 GO的其他修飾

磁性納米材料因擁有超順磁性、高矯頑力和比飽和磁強度高等優(yōu)良性質，使其成為生物醫(yī)學范疇研究的焦點，其中磁性四氧化三鐵(Fe3O4)粒子的應用較為廣泛。王俊梅[15]利用一步水熱合成法，制成了磁性Fe3O4通過表面改性后與GO結合獲得磁性微球/GO復合材料，通過對抗癌藥物5- FU的轉載，在不同 pH條件下釋放行為發(fā)現(xiàn)中空復合微球仍具有明顯的超順磁性。磁性GO還可以對中藥中難溶物質進行裝載后的高效利用，趙志娜[16]通過化學共沉淀法制備出磁性GO納米顆粒( Magnetic Graphene Oxide,MGO)，將其成功載入姜黃素(CUR)納米粒，制備CUR- MGO，對其進行物化表征后發(fā)現(xiàn)復合納米粒載藥量達到4.61%，藥物導入成功，在體外釋放測試中表明其釋放功能受細胞環(huán)境pH影響，在酸性條件下釋放較快。沈俊海[17]等通過氧化超聲剝離法制備出GO后通過化學共沉淀與Fe3O4復合，獲得一組質量比及組分不同的GO-Fe3O4復合物，通過表征及微觀構象的觀察，并負載阿霉素(DOX)進行正交試驗，結果表明溫度及DOX濃度及溶液pH均影響藥物的釋放，且具有pH依賴性。

3 氧化石墨烯作為藥物載體的研究

現(xiàn)今已有包合物、納米乳、微球等多類型藥物載體都可增加藥物溶解度、延長藥物的血液循環(huán)[18]，但由于載藥率低，難以對病灶部位進行高濃度、高靶向性給藥，因此，研發(fā)新型載藥材料成為不可避免的新趨勢。GO作為一種新型的藥物載體，以其優(yōu)異的載藥性和負載率、病灶靶向給藥等方面受到諸多關注。氧化石墨烯的水溶性雖然比石墨烯高，但是其存在在鹽溶液及生理條件下容易聚集的情況，為了改善體內的不穩(wěn)定性，學者們對其也進行了多樣化的修飾。且如何在負載的藥物釋放后，清除GO載體在體內產生的毒性，也是當今必須重視的問題。

3.1 GO載藥性能的研究

3.1.1 化學合成藥物的負載

當今的諸多藥物均存在水溶性及靶向性較差等問題，使藥物在體內的吸收減弱或難以到達病灶部位，若利用GO的生物相容性及溶解性等特性對藥物進行負載，可有效提高諸多藥物的藥效。楊琳等[19]通過動物實驗對比GO載入5- FU后的復合粒與5- FU本身殺滅致癌因子的能力，發(fā)現(xiàn)在藥物含量相同的條件下GO-5-FU殺滅乳腺癌4T1細胞的能力遠高于5- FU本身，說明GO具有對藥物的高負載率及靶向給藥功能。張龍姣等[20]先用葉酸對GO進行修飾，而后負載多柔比星，置于pH值為5的磷酸緩沖液中，在溫度恒定在37℃條件下觀察藥物的體外釋放，定時定量取反應時間間隔相同的反應物進行紫外分光光度法測定釋放量，結果顯示在釋放時長為157 h時，藥物累計釋放量為44.85%，與釋放時間呈正相關且具有緩釋性。Liu Z等[21]研究聚乙二醇修飾GO即NGO- PEG(簡稱NG-O)，作為納米載體，通過非共價鍵作用裝載難溶性抗癌藥物，NGO吸附SN38(喜樹堿)在機體環(huán)境下具有優(yōu)異的生物相容性和穩(wěn)定性，并且提高了SN38的水溶性，發(fā)現(xiàn)在體外實驗中對癌細胞HCT-116具有更高殺滅力。

3.1.2 傳統(tǒng)中藥的負載

中藥里含有多種生物活性物質，如黃酮類、多酚類物質等，含有較好的抗菌及抗氧化等優(yōu)異的性能，但其水生物利用率低、在體內不穩(wěn)定、水溶性差，若將其與GO制成復合納米材料，可以提高不溶于水的有效成分溶出，協(xié)助其藥物直達病處[22]，GO的抗菌性能在抗菌藥物領域具有寬闊的應用市場，與中藥的清熱解毒、鎮(zhèn)痛消炎等療效類似[23]。仇云兵等[24]將金絲桃素通過π-π堆積和氫鍵作用接枝到GO上，所獲得的產物具有良好的穩(wěn)定性并可提高金絲桃素的光敏性和吸附量。徐志遠等[25]采用PEG- GO對貝殼杉烷二帖類化合物毛萼乙素(eriocalyxin B)進行負載，負載后的毛萼乙素親水性和在鹽溶液中的穩(wěn)定性得到改良。且負載率達18.8%，通過對癌細胞A549的毒性試驗，發(fā)現(xiàn)PEG-GO-毛萼乙素對于細胞的殺滅能力遠高毛萼乙素本身。李龍劍[26]通過構建搭載蘆薈苷-GO水凝膠，對其體外抑菌性能測定、體內皮膚刺激性及疤痕修復考察。結果表明蘆薈苷-GO凝膠具有一定的緩釋功能，且有良好的抑菌效果，對皮膚沒有刺激性，還能促進皮膚血管新生，一定的復原創(chuàng)傷效果。

3.2 GO體內安全性的研究

3.2.1 GO體內毒性研究

隨著石墨烯及其衍生物在各大領域的應用，機體對這類材料接觸的機會日漸增長，因此，石墨烯材料的安全性不由得引發(fā)諸多熱議與關注。楊列程[27]利用PEG-GO負載陽離子兩親性藥物(CADs)，發(fā)現(xiàn)作為藥物載體的GO會增加由藥物引發(fā)的磷脂質病的概率。研究表明GO對細菌具有毒性作用，但細胞若長期接觸石墨烯，細胞表面會出現(xiàn)石墨烯聚集，可導致細胞凋亡[28]，使細胞的代謝率與石墨烯濃度呈負相關[29]。Zhang Y等[30]取系列質量濃度差的GO通過尾部靜脈注射進小鼠體內，當GO為小劑量時對小鼠無明顯毒性影響。當GO劑量達 0.40 mg，小鼠產生慢性毒性反應，其死亡率可達 44.4 %，肺部肉芽腫，GO沉積在各個器官，且無法從腎臟代謝排除。但另一研究發(fā)現(xiàn)GO在劑量為20mg/kg的情況下最初積累在肝、脾等臟器，后期又被機體代謝至微量毒性[31]。GO可以刺激線粒體制備活性氧(ROS)，激活炎癥及凋亡通路，造成重度肝功能不全，而聚集態(tài)和分散態(tài)的GO試驗的小鼠沒有明顯的肺損傷[32]。石墨烯及其衍生物的毒性多與材料的直徑、劑量濃度、表面形態(tài)有關，我們可以通過連接具有特定分散功能的物質來提高GO在體內的分散性和體內外安全性。例如可以使用聚乙二醇(PEG)對GO進行功能化修飾，修飾后的GO具有更好地靶向性，在緩沖液或血液環(huán)境中有穩(wěn)定的分散性，可降低在機體組織的毒副作用，經過PEG修飾的GO可以通過腎臟代謝以尿液形式迅速從體內排出，從而不會引起組織器官的明顯毒性[3]。

因此對于GO的毒性而言，不同的給藥途徑、劑量、實驗周期均會對毒性大小產生影響，而且作用機制尚未完全明確，因此我們不能對GO的毒性影響輕易下定論，需要更進一步的探索。

3.2.2 GO尺寸對毒性的影響

血液相容性是對生物醫(yī)學應用的重要毒性評價，溶血可能導致器官衰竭甚至機體死亡。研究發(fā)現(xiàn)GO的血液相容性和體內清除途徑與其尺寸大小有關[34-35]，尺寸為納米級別的GO會較易發(fā)生嚴重的溶血，而尺寸小至微米的GO不易引發(fā)溶血，但會易發(fā)凝血現(xiàn)象，為了降低溶血能力，需要在尺寸的修改上進一步對其結構進行改造。尺寸差異是GO作為載體在給藥系統(tǒng)體內清除途徑的決定因素，通常小于10nm的GO能夠快速地通過腎臟途徑清除[36]，而微米尺寸的GO 則會通過肝臟轉移至膽道系統(tǒng)中代謝清除[37]。關于GO的安全性研究雖已有一些結論，但生理系統(tǒng)的多樣性使得我們不能輕而易舉對其毒性的高低及清除率輕易得出結論，需進一步研究不同尺寸對給藥后清除率的影響及其作用機制。

4 結論與展望

氧化石墨烯作為藥物載體的應用日益增多，如抗癌藥物的負載和靶向治療、生物成像和光動力治療[38]，是一種優(yōu)點眾多的載體材料。對于目前GO的應用存在著幾個問題，第一是GO多以負載小分子藥物研究居多，對于負載如DNA、蛋白質等生物大分子較少。故可以令GO與更多的大分子結合來提高負載物質的多樣性。其二是對于GO的各類研究如靶向性與毒性多是在體外進行，缺乏體內實驗的數據，可以增加生物體建模的研究，對復合納米粒的四大體內過程進行探索，其三是石墨烯及其衍生物在機體內長期代謝沉淀的毒性物質仍需進一步研究，與藥物分子的相互轉化作用也仍需進一步探索[39]。通過解決這些問題可以實現(xiàn)GO的高效載藥及可控性，了解GO的作用機制及代謝途徑。總之，石墨烯及其衍生物在作為藥物載體這項研究中仍存在許多問題，需要各界科研團隊的加強學科融合，共同解決面臨的困難。