DNA定量檢測(cè)方法研究進(jìn)展概況

劉 霞，石會(huì)龍

(中國(guó)石油大學(xué)勝利學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，山東 東營(yíng) 257100)

作為一類生物大分子，脫氧核糖核酸(DNA)不僅是遺傳信息的載體，而且能夠影響生命機(jī)能和生物體發(fā)育。每條DNA鏈由兩條DNA單鏈構(gòu)成，兩條DNA單鏈連接構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu)。此外，每條DNA單鏈上都分布著堿基，構(gòu)成DNA雙鏈上的兩條DNA單鏈上的堿基按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行排布。

DNA不但對(duì)生命體正常的生長(zhǎng)繁殖和發(fā)育等生命活動(dòng)具有十分重要的作用，而且與生命的異常情況，包括腫瘤發(fā)生、放射損傷、遺傳疾病也有密切關(guān)系。DNA定量檢測(cè)在生物工程、藥理學(xué)、臨床診斷中有重要的作用。例如，乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)已成為了近年來研究的熱點(diǎn)之一。通過對(duì)HBV DNA進(jìn)行定量檢測(cè)可以得知肝炎患者的病毒血癥水平，準(zhǔn)確反映機(jī)體的病毒感染情況，從而彌補(bǔ)了定性檢測(cè)的不足。在此基礎(chǔ)上，病毒血癥水平可以提供抗病毒治療的依據(jù)及判斷其療效[1]。因此，對(duì)DNA定量分析方法展開研究具有重大意義。

1 DNA定量檢測(cè)的傳統(tǒng)方法

DNA的定量檢測(cè)有很多種方法。早期的DNA定量檢測(cè)方法主要包括紫外吸收法、定磷法、定糖法等。

在早期的DNA定量檢測(cè)方法中，紫外吸收法原理簡(jiǎn)單，操作方便，應(yīng)用非常廣泛。紫外吸收法的基本原理是：DNA在260 nm附近有最大吸收。據(jù)此，可以通過紫外吸收法對(duì)DNA進(jìn)行定量、定性測(cè)定。紫外吸收法具有簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，但是由于DNA的摩爾吸光系數(shù)僅103數(shù)量級(jí)，靈敏度較低，因此不適合檢測(cè)微量或痕量的DNA片段。

除紫外吸收法之外，定磷法和定糖法在早期也被廣泛應(yīng)用于DNA的檢測(cè)。定磷法的主要原理：由于磷酸基團(tuán)是核酸鏈的主要組成單元之一，且純的核酸中磷元素的含量較高，約為9.5%，所以可以通過測(cè)定磷元素的量來測(cè)定核酸含量。該方法反應(yīng)靈敏，適合檢測(cè)含量為10～100 μg/mL。與磷酸基團(tuán)一樣，脫氧核糖同樣是DNA鏈的重要組成部分，而且具有特殊的顯色反應(yīng)，因此可以根據(jù)定糖法進(jìn)行核酸的定量檢測(cè)。二苯胺法測(cè)定核酸方法就是以此為基礎(chǔ)的，這是一種較為古老且至今仍常用的一種方法。其基本原理為：在強(qiáng)酸性條件下，DNA發(fā)生水解反應(yīng)，水解后的DNA能與二苯胺反應(yīng)，生成藍(lán)色產(chǎn)物，在波長(zhǎng)為600 nm處有最大吸收峰，由此可以測(cè)得DNA的含量。該種方法準(zhǔn)確、靈敏度高，但是反應(yīng)周期冗長(zhǎng)，約為16～20 h[2-3]。

以上方法均為DNA定量檢測(cè)的方法，檢測(cè)方法較為準(zhǔn)確。但是其靈敏度普遍較低，只能達(dá)到10～400 μg/mL，不足夠用于微量或痕量DNA的定量檢測(cè)。而且，以上檢測(cè)方法檢測(cè)到的DNA濃度是指樣品中所有的DNA的濃度，并不能針對(duì)某一種特定的DNA序列進(jìn)行檢測(cè)。但是近年來，由于癌癥等疾病的出現(xiàn)都與DNA片段的突變等聯(lián)系密切，因此檢測(cè)微量特定序列的DNA的方法對(duì)于疾病診斷、臨床醫(yī)學(xué)來說非常有用。檢測(cè)某種特定序列的微量DNA變得意義重大，這一領(lǐng)域的研究也得到迅速的關(guān)注與發(fā)展。

2 特定序列的微量DNA的定量檢測(cè)方法

近年來，隨著分析化學(xué)水平的發(fā)展，涌現(xiàn)出很多關(guān)于特定序列微量DNA的檢測(cè)的方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymer chain reaction,PCR)、DNA雜交技術(shù)(Hybridization chain reaction,HCR)等。對(duì)于DNA濃度的獲得通常是通過熒光強(qiáng)度、紫外強(qiáng)度或者電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行表征。此外，在很多研究中，還利用了磁球技術(shù)、DNA探針標(biāo)記物等方法將檢測(cè)信號(hào)進(jìn)一步放大進(jìn)行。以上的一種方法或幾種方法的結(jié)合大大降低了DNA定量檢測(cè)的濃度下限，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。

2.1 PCR技術(shù)定量檢測(cè)微量DNA

近年來， PCR技術(shù)發(fā)展迅速，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。DNA 的天然復(fù)制過程以半保留復(fù)制的方式進(jìn)行。PCR技術(shù)的原理與DNA天然復(fù)制的過程類似，它的特異性依賴于位于目標(biāo)序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR的基本反應(yīng)步驟包括三步，即變性、退火、延伸。重復(fù)循環(huán)變.性、退火、延.伸三個(gè)過.程就可增加“半保.留復(fù)制鏈”的數(shù)量，而且形成的這種新.鏈又可以成為下次循.環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)大約需2～4 min，經(jīng)過2～3 h就能實(shí)現(xiàn)將待復(fù)制的DNA片段數(shù)量擴(kuò)增放大幾百萬倍，這使得DNA檢測(cè)的檢測(cè)限得到很大程度的降低，使檢測(cè)的靈敏度得到了提高。

張艷奇通過PCR技術(shù)對(duì)乙肝患者乙肝病毒(HBV-DNA)進(jìn)行了檢測(cè)。通過對(duì)327例乙肝患者樣品的檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率為96.43%，對(duì)疾病的早期治療具有指導(dǎo)意義[4]。

利用PCR技術(shù)檢測(cè)DNA有很多優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、特異性高、簡(jiǎn)便、快速、純度要求低。但是PCR技術(shù)的過程依賴于溫度的變化和精密的儀器，所以利用PCR技術(shù)檢測(cè)DNA的方法過程比較復(fù)雜，并且成本較高，耗時(shí)長(zhǎng)[5-6]。

2.2 利用DNA雜交反應(yīng)(HCR)技術(shù)定量檢測(cè)微量DNA

堿基互補(bǔ)配對(duì)原則是HCR技術(shù)的基礎(chǔ)。已知待檢測(cè)目標(biāo)DNA的分子的堿基序列，我們可以設(shè)計(jì)部分堿基序列與之互補(bǔ)的用DNA探針，使探針DNA分子與目標(biāo)DNA分子按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，形成DNA雙鏈片段。DNA雜交技術(shù)是DNA檢測(cè)研究中最常用和最基本的檢測(cè)方法之一，因此，圍繞該技術(shù)的新方法研究一直是人們感興趣的領(lǐng)域。

2.2.1 利用納米顆粒及磁性粒子等與HCR技術(shù)結(jié)合進(jìn)行微量DNA定量檢測(cè)

朱金坤等人通過磁性粒子對(duì)DNA實(shí)現(xiàn)了化學(xué)發(fā)光信號(hào)的表征檢測(cè)。首先，他們將DNA1標(biāo)記的CuS納米顆粒、目標(biāo)DNA、DNA2標(biāo)記的磁性粒子混合，通過DNA1、目標(biāo)DNA、DNA2之間的雜交反應(yīng)，使三者結(jié)合在一起。然后將通過磁性粒子的富集，實(shí)現(xiàn)其濃度的增大。將CuS顆粒溶解釋放，對(duì)其化學(xué)發(fā)光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA濃度的表征。通過此種方法獲得的DNA濃度檢測(cè)限為3.0×10-12mol/L，并且在1.0×10-11～ 1.6×10-9mol/L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系[7]。

沈麗萍等使用鏈霉親和素涂覆的磁性納米微球作為Ru(bpy)32+-NHS的載體對(duì)微量DNA進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。在外加磁場(chǎng)的固定下，磁性微球能較好地固定在工作電極上，而且未反應(yīng)到磁球上Ru(bpy)32+-NHS也可以在磁場(chǎng)的固定下很容易地清洗掉，從而保證電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的結(jié)果，不受到雜質(zhì)的影響[8]。

朱進(jìn)清等發(fā)展了一種基于“樹枝狀”信號(hào)放大的電化學(xué)生物傳感器用于微量DNA的定量檢測(cè)。在本項(xiàng)研究中，他們巰基修飾的DNA1作為捕捉探針固定到金電極表面，然后通過捕捉探針DNA1與目標(biāo)分子的雜交進(jìn)一步將目標(biāo)DNA分子固定。將巰基修飾的探針DNA2固定到金納米顆粒的表面，金納米顆粒為球形結(jié)構(gòu)，表面可以修飾多條DNA2分子。通過DNA2分子與目標(biāo)分子之間的雜交，形成了第一個(gè)“三明治”結(jié)構(gòu)。同理，cDNA分子加入，使之與DNA2分子雜交，隨后加入DNA1修飾的金納米顆粒，使DNA1與cDNA進(jìn)行雜交，形成第二個(gè)“三明治”結(jié)構(gòu)。然后加入釕胺分子，釕胺分子通過靜電作用會(huì)大量吸附在DNA分子上。最后通過計(jì)時(shí)電量法采集釕胺分子的電化學(xué)信號(hào)。通過兩次形成“三明治”結(jié)構(gòu)，對(duì)檢測(cè)信號(hào)實(shí)行了兩次放大。通過此方法，DNA的檢測(cè)限被降低到了0.13 pmol/L[9]。

2.2.2 利用酶與HCR技術(shù)結(jié)合進(jìn)行微量DNA的定量檢測(cè)

由于酶的催化特異性、高效性和反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)，酶被廣泛應(yīng)用于DNA的定量檢測(cè)中。在這些方法中，酶分子一般作為標(biāo)記物，通過探針DNA或者檢測(cè)DNA等與目標(biāo)DNA進(jìn)行定量的結(jié)合，然后催化相應(yīng)的酶的底物，產(chǎn)生可以檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)物。在這個(gè)過程中，產(chǎn)物信號(hào)的強(qiáng)弱取決于酶的數(shù)量。由于酶的數(shù)量與目標(biāo)DNA分子的數(shù)量之間存在對(duì)應(yīng)的數(shù)量關(guān)系，產(chǎn)物信號(hào)與目標(biāo)DNA分子之間也存在著定量的關(guān)系。因此，通過這種方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量檢測(cè)[10]。在酶放大技術(shù)檢測(cè)DNA的方法中最常用酶的種類一般為辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。辣根過氧化物酶含有血紅素，能利用H2O2氧化許多有機(jī)及無機(jī)化合物，并使底物發(fā)生顏色反應(yīng)。而堿性磷酸酶( AP) 具有分子量小、穩(wěn)定性好、活性高、易分離提純等優(yōu)點(diǎn)。并且與辣根過氧化物酶相比，其在緩沖液中可以直接催化底物發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)過程更簡(jiǎn)單、易于操作。堿性磷酸酶放大技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微量DNA的檢測(cè)。

張曉麗等人設(shè)計(jì)了一種方法，將捕捉DNA1固定到基板上，然通過捕捉DNA與目標(biāo)DNA之間的雜交反應(yīng)，將目標(biāo)DNA固定。將捕捉DNA2修飾到磁性微球的表面，由于磁性微球的球形結(jié)構(gòu)，一個(gè)磁性微球表面對(duì)用多條DNA2分子，通過DNA2分子與目標(biāo)DNA分子之間的雜交反應(yīng)，形成“三明治”夾心結(jié)構(gòu)。在此結(jié)構(gòu)中，一條目標(biāo)DNA分子對(duì)應(yīng)一個(gè)磁性微球。然后通過DNA2分子與目標(biāo)DNA分子之間的去雜交反應(yīng)，將磁性微球釋放收集起來。將堿性磷酸酶標(biāo)記的探針DNA3分子加入收集的磁性微球中，通過DNA2分子和DNA3分子之間的雜交反應(yīng)，將大量的堿性磷酸酶固定到磁球上。利用磁球的磁性對(duì)磁球進(jìn)行清洗、富集。將得到的酶標(biāo)磁球與其催化底物磷酸二苯酯二鈉陸續(xù)加入毛細(xì)管。在堿性磷酸酶的催化下，磷酸苯酯二鈉被轉(zhuǎn)化為苯酚。在毛細(xì)管的出口對(duì)苯酚進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)。磁球表面富集大量的堿性磷酸酶，因此每一個(gè)磁球會(huì)對(duì)應(yīng)一個(gè)苯酚的曲線峰。因此，可以表征目標(biāo)DNA的數(shù)量，進(jìn)而得到其濃度。在此方法得到的DNA濃度檢測(cè)的線性范圍為5.0 × 10-16～ 1.0 × 10-13mol/L[11]。

除了利用酶的催化性能，對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行二次放大之外，DNA內(nèi)切酶及外切酶也被廣泛應(yīng)用到了微量DNA的定量檢測(cè)研究領(lǐng)域。

郭秋平等設(shè)計(jì)了一種發(fā)夾型的DNA探針。當(dāng)不存在目標(biāo)DNA時(shí)，熒光染料可以嵌入該探針莖部，發(fā)出很強(qiáng)的熒光信號(hào)。加入目標(biāo)DNA后，目標(biāo)DNA與探針DNA進(jìn)行雜交，加入外切酶，從雜交產(chǎn)物的3'端水解探針DNA，釋放目標(biāo)DNA。同時(shí)，熒光染料也被釋放，熒光強(qiáng)度降低。通過對(duì)熒光強(qiáng)度變化的表征，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA濃度的檢測(cè)。該種方法的檢測(cè)限為320 fmol/L[12]。

3 結(jié)論與展望

縱觀DNA定量檢測(cè)的研究發(fā)展過程，我們發(fā)現(xiàn)DNA的定量檢測(cè)方法近幾十年來發(fā)展迅速，已經(jīng)成為了研究的熱門領(lǐng)域。檢測(cè)方法由最開始的紫外分光光度計(jì)法、定磷法、定糖法等初級(jí)的檢測(cè)手段，已經(jīng)向著PCR技術(shù)、HCR技術(shù)為基礎(chǔ)的更先進(jìn)的研究方向進(jìn)行。特別的HCR技術(shù)，由于不需要特定的儀器和復(fù)雜的控溫過程等，近年來更是得到了相當(dāng)大程度的發(fā)展。在HCR技術(shù)的應(yīng)用中，通過DNA分子的雜交形成“三明治”結(jié)構(gòu)更是與磁球放大技術(shù)、酶放大技術(shù)等可以進(jìn)行靈活結(jié)合，對(duì)電化學(xué)信號(hào)、光學(xué)信號(hào)等檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大或者二次放大，極大的降低了DNA濃度的檢測(cè)限，并且普遍獲得了較理想的線性范圍，推動(dòng)了微量DNA定量檢測(cè)方法的發(fā)展。在未來，基于HCR技術(shù)的DNA定量檢測(cè)方法仍然有很多發(fā)展的空間和可能性，一定會(huì)在分析化學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域得到更廣泛的推廣和應(yīng)用。