生物物證DNA污染的成因與預(yù)防

張飛，黎波

（新疆警察學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000）

生物物證作為證據(jù)物證的一種，主要包括人源性生物物證和非人源性生物物證[1]。人源性物證主要包括骨片、毛發(fā)、組織塊、血痕等組織器官，精液（精斑）、唾液（唾液斑）、糞便、尿、羊水、嘔吐物等分泌物和排泄物，此外還有指紋、唇紋、咬痕、足跡（赤足）等。非人源性生物物證主要有動物、植物、昆蟲和微生物等物證，如某些動物的血液（痕）、體液（斑），某些植物的液汁或其斑痕及其提取物等，一些可用以推斷死后間隔時(shí)間和所到區(qū)域的昆蟲或土壤中含有的包括各種細(xì)菌、真菌在內(nèi)的微生物等群體。

生物物證技術(shù)是在傳統(tǒng)法醫(yī)物證檢驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，廣泛應(yīng)用于刑事、民事案件的偵查檢驗(yàn)、鑒定。該學(xué)科涉及生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)等多門自然學(xué)科[2]。因此，生物物證在自然科學(xué)技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，在刑事案件中對于人源性生物檢材的種屬認(rèn)定起到關(guān)鍵性作用。隨著DNA提取技術(shù)以及二代測序技術(shù)的不斷完善，高通量測序在刑事案件人源性生物檢材的分析越來越受到重視[3-6]。然而，在實(shí)際生物物證DNA的提取和檢測過程中經(jīng)常會發(fā)生檢材污染的問題，無論是勘查提取人員的污染還是分析檢驗(yàn)人員的污染都不可避免，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本文針對DNA樣品提取分析過程常見的污染進(jìn)行分析討論，并提出可行性建議，以期減少檢驗(yàn)過程的樣品污染。

1 生物物證DNA的污染

造成DNA實(shí)驗(yàn)污染的因素主要分為外因和內(nèi)因，外因主要有:（1）自然形成的污染，主要是生物檢材暴露在環(huán)境中受到雜物的污染；（2）勘察人員在發(fā)現(xiàn)、運(yùn)輸、提取時(shí)造成的污染；（3）發(fā)生在物證流轉(zhuǎn)過程中導(dǎo)致的污染。內(nèi)因主要有實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用試劑污染、氣溶膠污染、核心設(shè)備污染，此類污染發(fā)生在物證檢驗(yàn)過程中，不易發(fā)現(xiàn)。

1.1 環(huán)境對生物檢材的污染

環(huán)境對生物檢材的污染是最普遍也是不可避免的，由于勘查人員勘查的是靜態(tài)的現(xiàn)場，是經(jīng)過作案人干擾過或作案人處理過的現(xiàn)場，有很多的不確定因素在里面，例如掉在血泊中的煙蒂、帶血的手套、水中的衣物、拋棄在垃圾桶中的物證等等，這些生物檢材在檢測過程中都會受到周圍環(huán)境的污染和干擾。特別是微生物細(xì)胞，或少量的人體脫落細(xì)胞等的污染，研究結(jié)果顯示，至少20個口腔上皮細(xì)胞或30個精子細(xì)胞檢測運(yùn)用Identifiler plus PCR試劑盒（美國AB公司）檢測，可以獲得全部分型。因此，越微量的物證越容易被污染。此類污染即使是微生物DNA片段在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)也會被擴(kuò)增出來無法去除，導(dǎo)致假陽性結(jié)果從而干擾分析。

1.2 生物檢材勘查提取過程造成的污染

現(xiàn)場勘察人員徒手提取物證，或使用未經(jīng)過消毒滅菌的器具提取物證，以及未及時(shí)更換一次性手套、剪刀、鑷子等情況都容易使樣品污染，另外勘察人員使用吸附性較好棉手套提取造成的吸附性污染，現(xiàn)場物證在運(yùn)輸時(shí)使用的包裝袋混裝、包裝袋破損泄露、包裝袋反復(fù)使用，物證袋生產(chǎn)環(huán)節(jié)出現(xiàn)污染等因素，都可以使檢材受到干擾，誤導(dǎo)檢驗(yàn)結(jié)果。

提取過程造成的污染，主要是生物物證在實(shí)驗(yàn)室提取檢驗(yàn)時(shí)，操作人員操作不規(guī)范或者環(huán)境不達(dá)標(biāo)等。例如物證進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，檢驗(yàn)人員初檢不認(rèn)真，使用不潔器具操作，或者未及時(shí)更換PE離心管、移液槍槍頭等一次性耗材，未清洗或未按規(guī)定更換上樣膠墊等，都容易造成樣本提取時(shí)交叉污染。或者是檢測人員在檢測過程中不小心將自己的唾液或皮屑混入到檢材中，導(dǎo)致“烏龍檢材”的出現(xiàn)，也會對檢測結(jié)果造成影響。

1.3 DNA純化試劑、氣溶膠的污染

試劑在配制分裝過程造成的污染，尤其是移液器操作不當(dāng)，最容易造成污染。特別在PCR擴(kuò)增中最容易導(dǎo)致污染，因?yàn)樵赑CR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的，經(jīng)過n個循環(huán)的擴(kuò)增，一個DNA分子的產(chǎn)量便達(dá)到2n個拷貝。PCR產(chǎn)物一般為 1013拷貝 /mL，取 0.1 mL 即為 109拷貝，而 1 mg人基因組DNA才含1.4×106拷貝的單拷貝基因片段。PCR反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增效率，使得極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

另一種是氣溶膠的污染，主要是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體，又稱氣體分散體系。分散相為固體或液體小質(zhì)點(diǎn)，其大小為10-3～10-7cm，分散介質(zhì)為氣體。氣溶膠污染的一般原因是離心管管蓋松懈導(dǎo)致泄露，在PCR反應(yīng)中，有高溫、低溫的周期性循環(huán)，高溫時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)液蒸汽溢出，擴(kuò)增儀頂蓋密封不嚴(yán)，多次擴(kuò)增不斷累積，達(dá)到足夠濃度時(shí)造成污染。此類污染難以清除，難以預(yù)測[7]。

1.4 核心設(shè)備污染

在提取、純化、擴(kuò)增生物檢材DNA時(shí)，常用的儀器設(shè)備有高速冷凍離心機(jī)、恒溫振蕩儀、PCR擴(kuò)增儀、3030XL遺傳學(xué)分析儀等設(shè)備。不按規(guī)定及時(shí)清洗，造成DNA產(chǎn)物分子級別堆積，形成設(shè)備內(nèi)部污染。比如，有些檢驗(yàn)人員在使用PCR擴(kuò)增儀時(shí)，剛擴(kuò)增完成就急于打開設(shè)備取樣，由于PCR擴(kuò)增儀溫度還未降下來，反應(yīng)體系也處于高溫狀態(tài)下，高溫膨脹使管蓋蹦出，會形成交叉污染。

2 生物檢材DNA污染對檢驗(yàn)結(jié)果的影響

DNA污染可能導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，干擾DNA分型圖譜的分析，誤導(dǎo)偵查人員。DNA污染可能會產(chǎn)生原本沒有的DNA信息，也可能會抑制、消除或完全覆蓋原有的DNA信息，從而造成嚴(yán)重后果[7]。比如可能在原本沒有犯罪嫌疑人DNA樣本的檢材上檢測出他的DNA，錯誤地刻畫犯罪嫌疑人，導(dǎo)致錯誤的案件定性，錯誤地推斷作案人數(shù)、作案人的性別等。這些都會誤導(dǎo)偵查方向，延誤破案時(shí)間。

3 預(yù)防生物檢材DNA污染的策略

在生物檢材DNA降低污染過程中，要做好“人防”和“物防”兩方面的工作，“人防”主要指在現(xiàn)場勘查中進(jìn)行生物檢材提取時(shí)，勘察人員首先應(yīng)樹立防污染的意識，首先做好自我保護(hù)，做到不污染樣品的同時(shí)也不讓樣品污染自己，勘查提取前先戴好口罩、帽子、防護(hù)服等必要措施，檢查勘查提取工具是否潔凈，確保樣品在源頭無污染，尤其是防止外來人源性污染。檢材越微量，越應(yīng)防止外來人源性污染；因?yàn)闄z材越微量，PCR檢驗(yàn)對外來人源性污染越敏感。“物防”主要指在實(shí)驗(yàn)室檢測過程中防止實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、核心設(shè)備等對樣品的污染。

3.1 遵守行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，按程序進(jìn)行提取與檢驗(yàn)

現(xiàn)場勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員在生物檢材提取、送檢、檢驗(yàn)過程中，必須按照中華人民共和國公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《法醫(yī)學(xué)物證檢材的提取、保存與送檢》（GA/T169—1997）規(guī)定的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行操作。在實(shí)驗(yàn)操作過程中嚴(yán)格按照儀器的操作規(guī)程進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)試劑的使用要符合標(biāo)準(zhǔn)，不可使用過期或污染的試劑。特別是DNA提取過程使用的試劑，比如酶、超純水、提取液等，都應(yīng)該進(jìn)行分裝和隔離保管。最應(yīng)注意的是移液槍槍頭的使用，必須是一次性的，按照一種試劑一個槍頭、一個樣品一個槍頭的原則，不可重復(fù)使用，交叉使用。

3.2 做好污染監(jiān)測設(shè)置對照

必須要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測，監(jiān)測樣品是否受到污染。通過有效的監(jiān)測，采取正確的相應(yīng)措施，防止或消除污染。另外對照試驗(yàn)也是監(jiān)測DNA污染的重要手段，所以無論是擴(kuò)增還是遺傳學(xué)分析都應(yīng)設(shè)置陰性和陽性對照。陰性對照是每次PCR實(shí)驗(yàn)都必須做的，它包括了標(biāo)本對照與試劑對照，通過對照確認(rèn)樣本和試劑是否受到污染。陽性對照是對預(yù)期結(jié)果而設(shè)置的，它是PCR反應(yīng)是否成功的一個重要的參考標(biāo)志。

3.3 人才培養(yǎng)與培訓(xùn)，提高行業(yè)人員能力

定期對相關(guān)人員包括現(xiàn)場勘查人員、檢材送檢人員、物證鑒定人員，進(jìn)行業(yè)務(wù)培訓(xùn)和專業(yè)知識學(xué)習(xí)，提高現(xiàn)場勘查能力和防污染意識，改變以往的“老牌作風(fēng)”和“經(jīng)驗(yàn)主義”，加強(qiáng)規(guī)范操作，確保檢材質(zhì)。

3.4 實(shí)驗(yàn)室布局與環(huán)境要求要達(dá)標(biāo)

生物物證受理室要和檢驗(yàn)區(qū)完全隔離開，初步處理室物品要按照受理順序排好序，并保持潔凈，檢驗(yàn)人員在進(jìn)行物證初級處理室做好防護(hù)，這是保證樣品不污染的第一道程序。原始試劑混配室應(yīng)為正壓間，操作過程在超凈臺內(nèi)完成，須防止其他程序功能間對本操作間的污染[8]。PCR擴(kuò)增室應(yīng)為微負(fù)壓區(qū)域，必須設(shè)置排風(fēng)系統(tǒng)，以防止大量擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散污染其他程序功能間。檢測室也應(yīng)為微負(fù)壓間，也必須設(shè)置排風(fēng)系統(tǒng)，以防止擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳測序過程中的擴(kuò)散污染；整個區(qū)域要注意溫度控制，因?yàn)镈NA分析儀及其他分析設(shè)備散熱量較大，會提高室內(nèi)溫度3～5 ℃，所以應(yīng)做好溫度檢測。

所有實(shí)驗(yàn)區(qū)域要進(jìn)行定期消毒滅菌，紫外燈滅菌在開展實(shí)驗(yàn)的2 h前進(jìn)行，檢驗(yàn)區(qū)域溫度控制在23℃左右。定時(shí)清洗維護(hù)核心設(shè)備，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

4 結(jié)語

生物物證檢材是DNA分析的原材料，避免檢材的污染問題必須做好“人防”和“物防”兩方面的工作，這是做好防止污染的第一步，防止DNA檢材污染，必須引起基層公安機(jī)關(guān)物證提取人員的高度重視，這不僅是相關(guān)檢驗(yàn)人員的責(zé)任，也是整個法庭科學(xué)從業(yè)人員和刑事科學(xué)技術(shù)人員的責(zé)任[9-10]。相關(guān)從業(yè)人員應(yīng)該提高自身技能、積極參加培訓(xùn)，在實(shí)際現(xiàn)場勘查過程和檢驗(yàn)中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作，嚴(yán)控管理實(shí)驗(yàn)室環(huán)境衛(wèi)生，才能保障DNA鑒定結(jié)論的真實(shí)客觀，才能為法庭科學(xué)提供可靠依據(jù)。本文重點(diǎn)介紹了生物物證檢材在現(xiàn)場勘查和分析提取過程中常見的DNA污染途徑和環(huán)節(jié)，并針對各個環(huán)節(jié)提出了可行性的建議，有望為檢驗(yàn)人員在生物物證提取、保存、送檢和檢驗(yàn)等過程中提供參考。