CAR-NK在腫瘤免疫治療方面的研究進展

李欣陽

（陜西師范大學，陜西西安 710100）

嵌 合 抗 原 受 體（Chimeric antigen receptor，CAR）T細胞已經在血液腫瘤的臨床治療上獲得了廣泛認可，2017年7月，Tisagenlecleucel被美國FDA認證可用于兒童和成人（3～25歲）的R/R B-ALL患者的治療，但CAR-T引發D的同種異體T細胞引起的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD），使得CAR-T在制備上只能用患者自體T細胞。自然殺傷細胞（Nature killer cell，NK）能以自發的方式殺死靶細胞，無主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）限制性，因此 CARNK在腫瘤免疫治療領域受到了更廣泛的關注。

1 NK細胞

NK細胞由造血干細胞分化發育而來，在限制腫瘤轉移方面尤為重要。常用的人NK細胞表型標志是 CD56+、CD16+、CD19-、CD3-，既不表達 T細胞的表型，又不表達B細胞的表型。根據NK細胞表達CD56分子表面密度，可將其分為CD56bright和CD56dim兩個亞群，CD56dimNK細胞亞群以殺傷功能為主，可介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 作 用（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC）。CD56brightNK細胞亞群以分泌細胞因子為主，且CD56dimNK細胞亞群比CD56brightNK細胞亞群更具天然細胞毒性。

NK細胞表面具有兩類受體。第一類受體可以激活NK細胞的殺傷作用，稱為激活性受體，包括NKG2D、NCR等；第二類受體可以抑制NK細胞的殺傷作用，被稱為抑制性受體，包括殺傷細胞免疫球蛋白 樣 受 體（Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）和NKG2家族（NKG2A、B、C和E/CD94）。主流觀點認為，NK細胞是通過活化和抑制受體信號之間的平衡來區分正常的健康細胞和敏感靶細胞，最終決定NK效應功能。

活化的NK細胞主要通過4種途徑發揮細胞毒作用。第一種途徑是穿孔素/顆粒酶途徑，通過細胞膜滲透性的增加引起靶細胞裂解。第二種途徑是Fas/FasL途徑。Fas向細胞傳遞“死亡信號”，與FasL結合，使靶細胞凋亡。第三種途徑是細胞因子途徑，激活目標細胞核酸內切酶，降解基因組DNA。第四種途徑是表達IgGFc受體，通過ADCC效應殺傷靶細胞。因此，NK細胞是臨床腫瘤免疫治療中極具潛力的淋巴細胞。

2 CAR-NK細胞

CAR-NK具有CAR-T的基本框架，包括細胞外抗原識別部分、跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。細胞外結構域是抗原識別位點，跨膜結構域是細胞內信號傳導組分的連接，細胞內信號傳導結構域衍生于 T 細胞受體（T cell receptor，TCR）/CD3。CAR-NK通常使用CD3ζ作為第一信號基序，加入共刺激分子基序，如CD28/CD137或CD28-CD137，以形成細胞內信號區域。

2.1 抗原識別區

抗原識別區通常由衍生自單克隆抗體（Monoclonal antibody，mAb）的重鏈和輕鏈的可變區片段（Single chain variable fragment，scFv）組成，通過柔性接頭融合在一起，無需抗原遞呈細胞的參與，即可將免疫細胞定向到腫瘤相關抗原（Tumor- associated antigen，TAA）。迄今為止研究的大多數scFv是鼠源的，會在人體內引起細胞介導的排斥或者致敏反應，或者引起人抗小鼠抗體（Human anti-mouse antibody，HAMA）或抗獨特型免疫應答，所以，許多研究人員正在探索人類化scFv以規避HAMA的發生，如抗人類表皮生長因子受體 2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的FRP5抗體等[1]。

為了提高CAR-NK特異性識別腫瘤的能力，可將NK細胞表面活化型受體的配體放在細胞外結構域的設計中，如NKG2D。NKG2D是在大多數CD8+T細胞和NK細胞上表達的關鍵活化受體，與死亡相關 蛋白 10（death-associated protein 10，DAP10）或DAP12轉移蛋白結合，提供不同的激活信號，這兩種信號均可激活NK細胞的細胞毒性。

2.2 細胞內信號傳導區

跨膜區一般被認為對CAR-NK細胞的整體結構和功能都沒有太大的影響。目前CAR-NK已經運用了多種跨膜區，如CD3ζ/CD8的跨膜序列等。CARNK活化信號的強弱是由胞內信號區的結構決定的，其所含的ITAM會在胞外受體與其配體相互作用被酪氨酸激酶磷酸化，從而招募Syk或者ZAP70，進而對下游蛋白磷酸化傳遞信號，CD3ζ是CAR結構的經典細胞內信號區段，CAR結構中含有單一ITAM的DAP12和含有3個ITAM的CD3ζ具有相同的活化下游信號的能力。

3 CAR-NK細胞用于抗腫瘤治療

近年來，CAR-T在多種血液腫瘤臨床治療取得了成果，但也存在如細胞因子風暴、GVHD等負面效應。NK細胞同種異體反應具有提高異基因造血干細胞移植治療的潛力，因此NK細胞被用于腫瘤免疫治療。CAR-NK的目標是建立新的激活途徑以增強細胞的抗腫瘤作用并改善腫瘤細胞靶向，它能夠對多種惡性腫瘤表現出較強的細胞毒性[2]。

大量臨床前研究已經測試了CAR-NK細胞對血液系統惡性腫瘤的各種靶抗原的療效，如CD19、CD20、CD138等。Shimasaki N等[3]在白血病小鼠模型中測試人NK細胞中含有CD3ζ和4-1BB信號傳導分子受體的表達，結果表明表達抗CD19-BB-ζ的NK細胞在體外對CD19陽性靶細胞具有高度細胞毒性，并分泌高水平的干擾素（IFN）-γ，在B細胞白血病的異種移植模型中發揮了相當大的細胞毒性。Chu Y等[4]在研究中發現，多次注射抗CD20 CAR修飾的exPBNK也延長了B細胞非霍奇金淋巴瘤（B-cellnon-Hodgkinlymphoma，B-NHL）腫瘤 -異種移植物的存活，抑制腫瘤細胞的遷移。

除治療血液腫瘤外，CAR-NK在實體瘤方面也 有 不 錯 效 果 ，包 括 HER-2 / Erb-2 等 靶 抗 原。Sch?nfeld K 等[5]將已建立的人 NK-92 細胞重定向至腫瘤相關的 ErbB2（即 humanepidermalgrowth factor receptor-2，HER2）抗原，構建攜帶CD28和CD3ζ信號傳導結構域的ErbB2特異性抗體FRP5（CAR5.28.z），產生表達人源化CAR的穩定克隆細胞系，結果顯示NK-92 / 5.28.z細胞在體外能有效裂解表達ErbB2的腫瘤細胞，顯示出連續的靶細胞殺傷作用。Liu等[6]人通過熒光激活細胞分選（FACS）在細胞表面上表達高水平融合蛋白的轉導的NK-92-抗erbB2 scFv-CD28-ζ細胞后，發現這些細胞特異性地增強了表達erbB2的人乳腺癌細胞系MDA-MB-453和SKBr3的細胞死亡。CAR-NK在實體瘤方面的發展以使其成為腫瘤免疫的新起之秀。

4 CAR-NK細胞的優勢與發展

最近加利福尼亞大學圣地亞哥分校[7]設計了9種靶向間皮素的CAR構建體進行體外殺傷實驗，并在小鼠模型中比較CAR-NK和CAR-T細胞的作用。結果顯示，CAR-NK細胞具有更小的毒性，比CAR-T細胞更安全。其次，同種異體NK細胞不會引發GVHD，并降低長期存在產生的毒副作用；此外，CAR-NK細胞保留了通過自身天然受體識別和靶向腫瘤細胞的內在能力。因此，與CAR-T細胞相比，即使理論上腫瘤細胞下調CAR靶抗原，它們也不太可能逃避NK細胞的免疫監視，同種異體NK細胞為免疫療法提供了應用潛力。

如何改造NK細胞才能表現出最佳效果，仍是未來CAR-NK研究領域的主要問題。CAR-NK作為一種新型的治療腫瘤的免疫方法，和其他抗腫瘤技術進行聯合運用為一些腫瘤患者帶來了希望，即使它存在不足但潛力巨大，希望之后的研究能夠使CAR-NK不斷的完善發展。