線粒體與卵子老化

劉曉娉，黃睿

(中山大學附屬第六醫院生殖醫學研究中心，廣州 510655)

自從輔助生殖技術的出現，排卵障礙、內分泌異常、盆腔炎性疾病等不孕患者的生育難題得到了很大程度的解決。但高齡婦女的助孕結局一直不盡人意，近幾十年的研究結果提示導致高齡女性生育能力下降的主要因素是卵子老化[1]。線粒體是卵子內含量最多的細胞器，能產生ATP和多種生物合成中間體，為卵子的成熟、受精及胚胎發育過程提供能量，同時參與細胞內多種生命活動過程，如維持鈣離子穩態、胞內信號傳導、細胞凋亡、細胞代謝等。

在單個原始生殖細胞中線粒體數量<10個，在卵子發育成熟過程中，其線粒體數量增至1×106個以上，這提示線粒體數量和功能可作為衡量卵子質量的重要指標[2]。與年輕女性相比，高齡女性卵子中的線粒體DNA(mtDNA)突變率明顯增高而拷貝數及線粒體膜電位明顯降低[3-4]，理論上改善線粒體功能和/或增加正常線粒體數量可以提高老化卵子質量，改善其發育潛能。自1997年將健康女性的卵細胞漿注射入質量差的卵子中并獲得活產的案例報道以來，各種線粒體替代治療和線粒體移植技術相繼問世，其中包括原核移植、紡錘體移植、極體移植、自體顆粒細胞線粒體移植、自體卵原前體細胞線粒體移植、自體脂肪干細胞線粒體移植、自體骨髓間充質干細胞線粒體移植等。然而由于安全隱患及倫理問題等因素，這些技術的臨床應用推廣備受爭議。同時，我們對線粒體移植的作用機制了解甚少。本文將闡述線粒體與卵子質量之間的關系，進而介紹線粒體移植在生殖醫學領域的發展歷史和分析其可能的作用機制。

一、線粒體與卵子質量

線粒體是半自主性細胞器，呈扁長形，由外膜、內膜、嵴和基質構成。人類線粒體遺傳物質(mtDNA)長約16.6 kb，呈雙鏈環狀，無組蛋白，其包含37個基因，編碼2種線粒體rRNA、22種tRNA和13種氧化磷酸化酶復合體蛋白亞基。線粒體是卵子胞質中數量最多的細胞器，不僅為卵子成熟、受精及胚胎發育過程提供能量，同時調控鈣離子穩態、細胞凋亡自噬等生命活動過程，其數量及功能異常將會對卵子受精和胚胎發育結局造成影響。

1.mtDNA拷貝數與卵子質量：mtDNA拷貝數在不同類型細胞中存在差異。與體細胞相比，成熟卵子mtDNA含量至少多一個數量級。在卵子發生、囊胚發育及著床后發育等階段都有mtDNA復制活動[5]。原始生殖細胞中含有約200個mtDNA拷貝數，隨著卵子發生，線粒體數量和mtDNA拷貝數均逐漸增加，直至卵子成熟完成受精時mtDNA拷貝數達到峰值；在囊胚發育階段，總體mtDNA拷貝數逐漸減少，但與內細胞團相比，滋養外胚層中的mtDNA拷貝數顯著增加，而內細胞團則維持低水平的mtDNA復制。著床前期參與原腸胚形成的胚胎干細胞mtDNA開始復制，余未分化細胞內mtDNA數量隨著細胞復制而減少，稱為“mtDNA稀釋”；直至著床后期，mtDNA稀釋停止，因已積累了足夠量的mtDNA，未分化細胞發揮新的特定的細胞功能[6]。

成熟卵子中需要有充足的mtDNA拷貝數，從而確保在胚胎著床后，每個子細胞有足夠的mtDNA用于復制重啟，為著床后的胚胎發育過程提供足夠的能量。該mtDNA拷貝數下限值即為卵子發育能力的關鍵閾值，在人類該閾值為100 000[7]。小鼠實驗表明，mtDNA拷貝數減少導致胚胎囊胚形成率下降[8]；而成功體外受精卵的平均mtDNA拷貝數也顯著高于未成功受精卵的mtDNA拷貝數[3]。這說明卵子中的mtDNA拷貝數影響其發育潛能和受精能力，增加線粒體數量可能提高發育潛能、增強受精能力。因此，線粒體數量或mtDNA拷貝數可以作為衡量卵子質量優劣的標志之一。

2.mtDNA突變與卵子質量：mtDNA缺少組蛋白，鄰近的電子傳遞鏈能產生大量的活性氧(ROS)，且mtDNA的修復酶能力有限，使其容易發生突變，mtDNA的突變率是核基因的25倍[9]。突變mtDNA的聚集可以通過影響呼吸鏈功能干擾卵子的成熟。在卵子成熟過程中，微管和細胞分裂活動的必要能量由線粒體提供。一旦呼吸鏈功能受到損傷，ATP產生減少，線粒體不能提供足夠的能量，就會干擾紡錘體上微管蛋白聚合和解聚，影響減數分裂染色體的分離，影響卵子質量。

目前為止，研究人員已經找出超過150種不同的mtDNA突變方式。早在1993年，Kitagawa等[10]首次發現人類卵巢組織存在mtDNA4977 bp缺失，且隨著年齡的增加，其缺失率也明顯增加。之后Keefe等[11]證實與年輕女性相比，高齡女性有更高的mtDNA 4977 bp缺失率，且認為這與其生育潛能低下有關。除此之外，Hsieh等[12]在人卵中檢測到了另外12種mtDNA缺失，并認為mtDNA缺失可導致線粒體功能障礙和ATP生成受損，從而干擾卵子受精和進一步的胚胎發育。機體在有氧代謝過程中伴隨著ROS的產生隨著年齡的增加機體所累積的ROS會增加，高齡婦女卵子中高濃度的ROS以及受損的抗氧化防御機制使得mtDNA的突變率增高，進而引發受精率低、胚胎發育異常及反復流產等不良結局[13]。

3.氧化應激與卵子質量：線粒體在產生ATP的同時伴隨著ROS的產生。正常情況下，機體內氧化水平和抗氧化水平處于一種動態平衡中。研究表明，適量的ROS參與卵泡發育、卵子成熟、排卵、黃體生成和卵泡閉鎖等生理活動過程[14]。機體內ROS與抗氧化劑之間的動態平衡對卵子正常生長發育有著重要的作用，機體的抗氧化能力隨著年齡增長而減弱，隨之面臨的是ROS的積累。過多的ROS可破壞線粒體內膜的極性孔(mPT)，導致鈣離子和細胞色素C外流，造成線粒體膜電位消失，線粒體凋亡程序啟動導致減數分裂周期停滯和細胞凋亡[15]，在胚胎中則表現為卵裂球溶解及細胞碎片增多。另外，高濃度ROS抑制鈉鈣交換體和鈣離子信號分子鈣調蛋白活性，導致內質網鈣池儲存鈣離子減少而細胞質中鈣離子增加，打破原有的鈣離子穩態平衡[16]，最終致使卵子凋亡。研究報道，與形態正常的胚胎相比，出現細胞碎片的胚胎中ATP和ROS水平顯著升高[17]；對小鼠MⅡ期卵進行光致敏造成線粒體損傷后，后續的胚胎發育及胎鼠的出生率均受到影響[18]。

線粒體在卵子成熟、受精及胚胎發育過程中有著至關重要的作用，線粒體數量不足和(或)功能障礙都將影響妊娠結局。線粒體治療的出現為這類問題的解決提供了新的方向。

二、線粒體治療發展歷史

1.線粒體替代療法：線粒體替代療法(mitochondrial replacement therapy，MRT)，即用健康的外源性線粒體補充或替代卵子或合子內異常的線粒體，可以改善卵子質量提高其發育潛能，但其產生的安全隱患和倫理問題引發爭議。早在1997年，Cohen等[19]首次將健康女性的卵細胞漿注射到反復卵子質量差的患者卵子中并獲得活產。次年，Van Blerkom等[20]將卵子中富含線粒體的胞質分離并注射入另一MⅡ期卵中，發現受體卵子ATP含量增加且保持一定的活性。但引入外來的胞質會帶來異質性的安全問題，同時胞質內含有的其他生物成分是否會對卵子造成傷害也是未知的。隨著克隆技術的發展，除了卵胞質移植外，原核移植(pronuclei transfer，PNT)、生發泡移植(germinal vesicle transfer，GVT)、紡錘體移植(spindle transfer，ST)及極體移植(polar body transfer，PBT)等技術相繼出現。2016年，世界首例“三親嬰兒”于墨西哥誕生，該案例正是利用ST技術后進行輔助生殖技術助孕并最終產出子代。然而，外源性線粒體的引入可導致后代攜帶兩種不同來源的線粒體，線粒體的異質性或許可以通過表觀遺傳影響子代的性狀，可能給子代帶來即時或長期的健康隱患。同時，由于第三方遺傳物質的引入所形成的“三親嬰兒”也勢必會引起法律和倫理上的爭議。

2.線粒體移植技術：線粒體移植技術，即體外分離供體細胞的線粒體，將其通過顯微注射注入MⅡ期卵子。既避免了分離卵胞質和核移植等技術要求高的問題，也可利用自體細胞作為供體，最大程度減少了后續的倫理問題，現已成為該領域的研究熱點。

Tzeng等[21]在2001年首次報道了自體顆粒細胞來源線粒體移植入卵子并成功妊娠的案例。孔令紅等[22]的研究表明自體顆粒細胞線粒體移植可明顯改善胚胎發育質量，提高妊娠率。加拿大OvaScience公司分離患者卵巢里的卵原前體細胞(卵巢干細胞)，從中分離提取線粒體注射入卵子中，并進行體外受精，誕生了世界上首個“干細胞嬰兒”。2015年，Oktay等[23]對10位反復助孕失敗的患者進行卵原前體細胞線粒體移植，臨床妊娠率達40%。但Labarta等[24]的一項卵原前體細胞線粒體移植隨機對照實驗結果提示這項技術并不能改善妊娠結局，盡管該研究利用分子標記物對線粒體供體細胞進行了鑒定，但并不能完全明確其細胞性質，同時研究報道也沒有明確其注射線粒體拷貝數的定量方法及具體注射劑量，因此并不能據此否定其對人類卵子質量的改善作用。2018年梁曉燕團隊報道了首例應用自體骨髓間充質干細胞來源的線粒體移植入卵子后，行輔助生殖技術助孕并成功活產男嬰的案例[25]。除了臨床研究以外，動物實驗發現肝細胞或自體脂肪組織來源的線粒體移植入卵子后均可以明顯提高老齡小鼠卵子的發育潛能[26-27]。

三、線粒體移植改善卵子質量的可能機制

卵子中線粒體過少或mtDNA突變會導致線粒體功能異常，影響卵子成熟、受精及胚胎發育，理論上增加線粒體數量或改善線粒體功能可以提高卵子質量，改善妊娠結局。已有文獻表明，分離純化的線粒體可以快速、直接進入哺乳動物細胞中并正常發揮自身功能[28]。那么，線粒體移植后是如何改善卵子質量的？下面就幾種可能的作用機制進行闡述。

ATP的產生依賴于線粒體內膜上一條完整的氧化呼吸鏈復合體。氧化呼吸鏈的損傷將導致ROS水平上升，ATP水平下降。Tarin等[29]提出卵子老化的“氧自由基——線粒體損傷學說”，認為隨著年齡的增長，卵子內會堆積過多的ROS繼而影響ATP的生成，能量生成受阻會干擾紡錘體微管蛋白的聚合解聚過程，染色體分離過程受到影響，從而導致非整倍體的發生。將體外分離的線粒體注射入卵子后，增加了mtDNA的拷貝數，增加ATP的生成[29]，使微管蛋白聚合和解聚過程的能量得以補充，減少卵子非整倍體的發生，從而提高卵子發育潛能。

線粒體具有高度的活動性，可以連續不斷地進行融合與分裂。線粒體的融合與分裂平衡對維持線粒體正常形態、功能有重要作用。線粒體融合蛋白Mfn2對小鼠卵子成熟至關重要[30]，當敲除線粒體融合基因后可導致卵子成熟障礙，胚胎發育潛能及相應的胚胎質量下降。老化卵子中高濃度的ROS促進線粒體分裂，從而破壞線粒體的數量平衡。高齡女性卵子與年輕女性卵子相比，線粒體分裂活動更加旺盛，從而產生更多的線粒體碎片[31]。過多的線粒體分裂活動可通過ROS/NF-kB信號通路上調基質相互作用分子(STIM1)表達和鈣池操縱性鈣內流從而導致胞漿鈣離子濃度增加[32]。眾所周知，依賴于鈣離子的釋放和/或積累的信號通路在動物胚胎的各種發育進程中起著重要作用，可影響細胞的分化命運和形態。外源性線粒體進入卵子后，可能重新調節線粒體融合和分裂的穩態平衡，調節細胞內外鈣離子濃度，使得細胞各項生理活動得以正常進行，從而改善老化卵子質量，提高其發育潛能。

另一方面，老化卵子中ROS的積累導致氧化損傷，導致線粒體功能障礙和細胞損傷[33]，其中過量的ROS累積會影響線粒體自噬。ROS調控線粒體自噬的機制包括ROS-PINK1/Parkin、ROS-HIF1-BNIP3/Nix、ROS-FOXO3-LC3/BNIP3和ROS-NRF2-P62等通路[34-37]。Niu等[38]的實驗結果表明PINK1的下調誘導線粒體伸長和腫脹，降低線粒體DNA拷貝數，導致ATP缺乏，顯著增加自噬和凋亡，顯著影響囊胚的形成和質量。ROS作為PINK1/Parkin通路的上游信號分子，老化卵子內高濃度的ROS是否下調了PINK1的表達使自噬功能受損最終導致卵子發育潛能變差，以及外源性線粒體是否通過重新調控線粒體自噬而改善卵子質量，這需要進一步的實驗去探索。

四、展望

在近二十幾年里，輔助生殖技術有了巨大的進步，但卵子老化及胚胎質量低下仍然是生殖醫學領域的難題，越來越多的學者將目光聚焦在線粒體移植治療上，但目前對線粒體移植治療的臨床應用所帶來的倫理和安全問題存在爭議。關于線粒體移植療法的循證醫學證據及基礎研究相對較少，其有效性和安全性也需要更多的實驗研究進一步驗證。