梅花鹿鹿茸片及近源品種真?zhèn)舞b別

李明月，王倩雯，石瑤，張敏

(錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001 )

鹿茸是一種傳統(tǒng)的動(dòng)物性中藥材，鹿茸具有養(yǎng)血的功效，還具有壯元陽，補(bǔ)腎，補(bǔ)氣血，抗衰老的作用，在中國具有特殊的意義，是古代帝王的象征。我國勞動(dòng)人民的生活水平逐步的提高對鹿茸等的以往的奢侈品的需求量也是逐年的增加，鹿茸已經(jīng)成為一種常用藥。

鹿茸是指雄鹿的未骨化的多毛的幼角，藥用的時(shí)候是從頂端慢慢向下切的一種半透明、角質(zhì)樣、無蜂窩狀小孔的飲片。在《中華人民共和國藥典》的2000年版終只規(guī)定了產(chǎn)于東北三省和河北等地的梅花鹿和馬鹿是地道的正品藥材。最近幾年價(jià)格低而且質(zhì)量次的新西蘭鹿茸，冒充我國的梅花鹿鹿茸和馬鹿茸占領(lǐng)市場，尤其是其切片茸等初加工品冒充現(xiàn)象更為嚴(yán)重，即使在雙陽，四豐等梅花鹿的主要產(chǎn)地、產(chǎn)區(qū)，各大城市的一些名牌參茸經(jīng)銷店也毫不例外， 影響我國正品鹿茸的國際市場的銷售，阻礙了我國的養(yǎng)殖業(yè)的健全成長。更應(yīng)引起注意的是這些冒牌產(chǎn)品在我國藥典中是絕不允許，也是我國養(yǎng)鹿界和醫(yī)療保健界近年一直反對的。

市場上的含有部分或者微量鹿茸成分的丸劑、散劑及原生藥，利用傳統(tǒng)的方法很難鑒定其真?zhèn)危肞CR技術(shù)不僅對整個(gè)鹿茸、鹿茸片、破碎的鹿茸進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，而且對這種丸劑，散劑可以進(jìn)行有效的真?zhèn)舞b定，對其純度大小的檢查與質(zhì)量好壞評定。生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得從DNA分子水平鑒定近源的中藥材已經(jīng)成為育種全新的準(zhǔn)確而快捷的中藥材鑒定手段，發(fā)展成為一門學(xué)科成為分子生藥學(xué)，主要是對生藥的DNA 分子進(jìn)行鑒定內(nèi)容的學(xué)科。

在巨大的利益的驅(qū)使下，梅花鹿鹿茸的混淆品和近源偽品越來越多。它在很大程度上制約了中醫(yī)的現(xiàn)代化、規(guī)范化和國際化發(fā)展。 藥劑鑒定與質(zhì)量評價(jià)工作越來越棘手，其真?zhèn)舞b定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過生物學(xué)技術(shù)鑒定打破了中藥常規(guī)鑒定的界限, DNA分子遺傳標(biāo)記不僅可以準(zhǔn)確地鑒別中成藥中的微量生藥成份還可以從種或種以下水平進(jìn)行近緣種的準(zhǔn)確鑒定，不受組織或藥材部位對鑒定的影響，因而對于準(zhǔn)確、合理、安全用藥、保障患者的權(quán)益具有重要意義。 鹿產(chǎn)品采用DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)鑒定，取樣量少避免了樣品的損耗，可以直接從動(dòng)物樣本中采集樣品，這樣不會(huì)導(dǎo)致整個(gè)樣本的破壞，并且具有自己的特殊亮點(diǎn)。 在該研究中，可以通過設(shè)計(jì)引物來鑒定同源鹿茸。而且不用測序達(dá)到即準(zhǔn)確快捷又節(jié)省成本，利于實(shí)行。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品從吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)參茸中心獲取的梅花鹿鹿茸和新西蘭鹿的鹿茸。樣品數(shù)量：梅花鹿茸片10個(gè)，新西蘭鹿的茸片10個(gè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA的提取。首先用70%的酒精對鹿茸片進(jìn)行清洗，時(shí)間是3min之后放在烘箱中溫度控制在37℃，讓其中的酒精盡快的揮發(fā)，否則影響DNA的提取結(jié)果。按照常規(guī)的酚/氯仿進(jìn)行DNA 的提取，稀釋為50ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用引物：上游引物 5′-TACTGCCGCTGACGTATTACG-3′。下游引物 5′-GATGGCTCTGGCAACGCGCT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)物組成：總DNA模板是50ng/μL,加2μL；2.5mM的 dNTP 加2μL ；rTaq聚合酶0.2μL；10×PCR Buffer 加2μL ；特異性引物各10pm/μL，加各加1μL；,加滅菌的去離子水16.8μL。試驗(yàn)反應(yīng)參數(shù)：94℃ 9min,94℃,53.2℃ 1min,72℃ 50s ,30個(gè)循環(huán)，72℃ 10min,PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3 電泳及觀察分析。利用1%的瓊脂糖檢測PCR擴(kuò)增的結(jié)果，在UVP凝膠圖像分析系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

PCR鑒定的結(jié)果：從圖1看出梅花鹿和新西蘭鹿具有明顯的區(qū)分性。

圖1 依次為1是陰性對照，新西蘭(2～3)，梅花鹿(4～6)

3 討論與結(jié)果

新西蘭鹿茸現(xiàn)在是鹿產(chǎn)品中主要的近源偽品，利用新西蘭鹿角，新西蘭鞭，新西蘭鹿胎來冒充正品的梅花鹿的角、鞭和梅花鹿胎給消費(fèi)者帶來虧損。

在本試驗(yàn)中利用特異性的引物采用PCR方法擴(kuò)增梅花鹿及其近源品種新西蘭鹿的鹿茸總DNA，只需通過PCR分析條帶的差別就能特異性地鑒別出鑒別出新西蘭和梅花鹿的鹿茸及其制劑。在高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腜CR擴(kuò)增條件下二種鹿具有明顯的條帶的區(qū)別,且結(jié)果穩(wěn)定而不需要序列的測定，防止傳統(tǒng)的鑒別的方法的周期長，價(jià)格偏高的弊端，采用此方法方便迅速在同樣的試驗(yàn)條件下對梅花鹿和新西蘭鹿茸的樣本的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果在條帶個(gè)數(shù)之間存在顯著的區(qū)別。

在陰性對照上且沒有出現(xiàn)條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是確實(shí)靠的住的。新西蘭鹿茸(2～3)與梅花鹿茸(4～6)在500bp～250bp， 梅花鹿茸擴(kuò)增具有3個(gè)條帶，鹿茸最明顯的區(qū)別是在500bp～250bp， 新西蘭鹿茸的擴(kuò)增結(jié)果有二條明顯的條帶，兩種樣品各具有自己特異的條帶數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對梅花鹿的鹿茸片劑混淆品和代用品新西蘭鹿的鑒別具有重要的意義，對現(xiàn)實(shí)中偽品的鑒別提供的重要參考價(jià)值。