中華蹄蓋蕨抗番茄潰瘍病菌活性物質提取工藝優化及其抑菌作用研究

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(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006; 2.山西大學應用化學研究所,山西太原 030006)

中華蹄蓋蕨(Athyriumsinense)屬于真蕨目、蹄蓋蕨科、蹄蓋蕨屬,在我國的華北地區多有分布[1-3]。蹄蓋蕨屬包含蕨類植物160余種,是真蕨植物主要的藥用科屬之一。早有研究表明蹄蓋蕨屬的中華蹄蓋蕨具有驅蟲、消腫、利尿、清熱解毒的功效[3]。番茄潰瘍病是目前番茄生產中危害性最為嚴重的病害之一,該病由密執安棒形桿菌密執安亞種(番茄潰瘍病菌Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)感染番茄所致。番茄潰瘍病菌于幼苗期至坐果期均可侵染番茄,且一經感染發病面積會訊速擴展,導致番茄大量減產且品質降低[4]。目前針對于番茄潰瘍病菌的抗菌藥物仍以化學殺菌劑為主[5],但化學殺菌劑在抑菌過程中存在藥物殘留和超標問題,同時還會破壞土壤平衡體系[6-8]。由于大眾食品安全意識的覺醒,人們不僅對農產品的品質要求有所提高,對農產品生長、成熟、運輸過程中所施農藥、激素等物質的殘留也有所關注[9-10]。在解決病害的同時,尋找更為安全、健康的殺菌劑是目前研究的趨勢。孟邵禮等[11]進行了擬銀杏殺菌劑的研究,最終研發出了更為高效、安全、環保的擬銀杏抑菌劑并申請了國家發明專利。因此,本研究以開發植物源殺菌劑為出發點,旨在研究一種新型、綠色、環保的抗番茄潰瘍病菌的植物源殺菌劑。

目前國內外僅有少數學者對植物源活性物質抗番茄潰瘍病菌的抑菌效果進行了研究。楊鶴[12]和Govindappa等[13]分別對人參總皂苷和南美蟛蜞菊水提物的抗菌活性進行了普查,結果表明二者對番茄潰瘍病菌均具有抑菌效果。張秀娟[14]測定了梓樹中抗菌活性物質對多株病原菌的抑制作用,結果表明其對番茄潰瘍病菌有相對較弱的抑制效果。Kotan等[15]對牛至精油的抑菌活性進行了廣譜抑菌篩查,結果表明牛至精油對番茄潰瘍病菌具有抑菌作用。可見,目前國內外學者對植物抑菌物質抗番茄潰瘍病菌的研究僅僅停留在抗菌活性普查這一階段,并未進行進一步深入探索。本課題組前期研究結果[16]表明中華蹄蓋蕨對馬鈴薯環腐病菌有較強的抑菌作用。由于馬鈴薯環腐病菌與番茄潰瘍病菌同屬于棒狀細菌屬,課題組推測中華蹄蓋蕨對番茄潰瘍病菌也具有抑菌效果。

因此,本研究以番茄潰瘍病菌為供試菌,以中華蹄蓋蕨為材料,對其抗番茄潰瘍病菌活性物質的提取工藝進行優化,并且分析該活性物質對番茄潰瘍病菌體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、胞內及胞外可溶性蛋白含量的影響,以期為中華蹄蓋蕨活性物質應用于番茄潰瘍病菌的綠色防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華蹄蓋蕨(A.sinense) 由山西大學生命科學學院植物實驗室鑒定,采自山西省呂梁市龐泉溝自然保護區;番茄潰瘍病菌(C.michiganensissubsp.michiganensis，cgmcc 1.1909) 中國普通微生物菌種保藏管理中心提供;供試培養基(蛋白胨10.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,吐溫-80 50 mg,牛肉膏2.0 g,酪蛋白氨基酸5.0 g,酵母提取物5.0 g,甘油2.0 g,麥芽提取物5.0 g,瓊脂15～20 g,蒸餾水1000 mL,pH=7.2) 以上試劑均為分析純,北京奧博星生物技術有限責任公司；2,7-二氫二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)、可溶性蛋白檢測試劑盒 南京建成生物工程公司；二甲基亞砜(DMSO) 分析純，天津市光復精細化工研究所。

F-280型熒光分光光度計 天津港東科技股份有限公司;JY92-Ⅱ超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52C旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;TGL-16G-C冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌物質提取工藝流程 中華蹄蓋蕨→反復清洗,置于暗處→自然晾干→粉碎成粉末→過50目篩→乙醇回流提取→過濾、合并濾液→減壓濃縮、干燥→得到干膏樣物質

操作要點:取一定量中華蹄蓋蕨,粉碎過50目篩,以乙醇為溶劑,在一定的料液比、一定溫度和一定時間下回流提取，干燥后(30 ℃下烘干)的粉末。提取液在2500 r/min下離心15 min。所得液體真空條件下減壓濃縮得到抑菌活性物質。采用40%的DMSO將其溶解,使最終濃度達到20 mg/mL。各個實驗條件下所得中華蹄蓋蕨活性物質的抑菌效果以其對番茄潰瘍病菌的抑菌圈直徑大小為評價指標。

1.2.2 活性物質抑菌效果的檢測 參照文獻[17]采用平板打孔法進行抑菌效果的檢測,具體操作如下:將菌液均勻涂布于平板培養基上,每板打三個孔(直徑10 mm)。除去孔內培養基,并向每孔內加入各提取條件下所得活性物質0.2 mL。設置對照組為每孔內加入0.2 mL 40%的DMSO溶液。各處理組與對照組于28 ℃條件下培養24 h,測量每組抑菌圈的直徑。

1.2.3 單因素實驗 采用上述1.2.1法,固定提取溫度為60 ℃、提取時間為6 h,考察不同料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL對抑菌能力的影響;固定料液比為1∶10 g/mL、提取時間為6 h,考察不同提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃對抑菌能力的影響;固定料液比為1∶10 g/mL、提取溫度為60 ℃,考察不同提取時間6、8、10、12、14 h對抑菌能力的影響。

1.2.4 正交試驗 在單因素實驗的基礎上,選用正交試驗優化中華蹄蓋蕨抑菌活性物質的提取條件。選取料液比、提取溫度、提取時間為考察因素,每個因素設置三個水平,分別采用1、2、3進行編碼,如表1所示。按照表2進行L27(313)的正交試驗。并按上述1.2.2法進行抑菌效果的檢測。

表1 提取工藝的變量及水平Table 1 Extraction variables and levels

1.2.5 抑菌物質對菌體活性氧水平的影響

1.2.5.1 待測樣品的制備 將上述正交試驗最優水平下的中華蹄蓋蕨提取物置于旋轉蒸發儀中蒸發至膏狀,加入到滅菌后的液體培養基中(以1% DMSO助溶),使活性物質的終濃度分別達到0.24、0.18、0.12和0.06 mg/mL。向各樣品中均加入200 μL濃度為108CFU/mL的番茄潰瘍病菌懸液,150 r/min,28 ℃下置于搖床培養8 h。以僅加入1% DMSO,而不加入中華蹄蓋蕨提取物的番茄潰瘍病菌懸液為對照。

1.2.5.2 菌體活性氧水平的測定 培養8 h后,所有樣品在3000 r/min下離心5 min,棄去上清液,用磷酸緩沖液(PBS)調整其OD600為0.5。取各樣品2 mL,3000 r/min下離心5 min,棄去上清液,進一步使樣品懸浮于500 μL濃度為20 μmol/L的2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)中,避光、室溫條件下孵育30 min。樣品洗滌2次后加入2 mL的PBS,吹散至均勻分布。取完成標記的樣品液體100 μL,溶解到1 mL的PBS中。用F-280型熒光分光光度計對樣品進行活性氧水平的測定,以熒光強度表示[18]。具體參數設定為:λem為535 nm,λex為488 nm,二者狹縫均為5 nm。

1.2.6 抑菌物質對細胞外可溶性蛋白的影響 按1.2.5.1進行待測樣品的制備。各樣品培養8 h后,于8000 r/min下離心5 min。取上清液,按照試劑盒說明書進行胞外可溶性蛋白含量檢測。其標準曲線為Y=0.2493x+0.3173(R2=0.9951)。

1.2.7 抑菌物質對細胞內可溶性蛋白的影響 按1.2.5.1進行待測樣品的制備。各樣品培養8 h后,所有樣品在8000 r/min下離心5 min,棄去上清液,并用PBS調整其OD600為0.5。取各樣品2 mL,用超聲波破碎儀進行細胞破碎(200 W,超聲2 s,間隔4 s,共15 min)。用冷凍離心機以12000 r/min離心5 min,除去細胞碎片,按照試劑盒說明書,以上清液進行胞內可溶性蛋白含量檢測。

1.3 數據處理

每組做三次平行實驗,測定值以平均值±標準偏差表示。以SPSS 23.0軟件進行ANOVA顯著性差異分析(P<0.05),用Origin 8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

圖1A表明,中華蹄蓋蕨活性物質的抑菌能力隨料液比的加大,出現先上升后降低的現象。料液比為1∶5 g/mL時,抑菌效果較差,抑菌直徑為14.74 mm。增加溶劑比例,抑菌能力增強。當料液比為1∶15 g/mL時,抑菌效果最強,抑菌直徑達到24.87 mm。進一步提高料液比,抑菌能力減弱。分析原因可能為,料液比過低時,中華蹄蓋蕨粉末不能完全溶解于溶劑中,導致抑菌活性物質無法完全提取出,抑菌效果較差。料液比高于1∶15 g/mL時,增加的溶劑延長了后期減壓濃縮的時間,活性物質遭到破壞。因此根據差異顯著性分析結果(圖1A),選取三個抑菌效果較優且有顯著差異(P<0.05)的料液比(g/mL)條件,即1∶10、1∶15、1∶20 g/mL進行后續正交設計。

圖1 料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C) 對活性物質抑菌效果的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid(A),extraction temperature(B)and extraction time(C) on antibacterial effect of active substances注:以不同小寫字母表示數值間 存在顯著差異,P<0.05；圖3～圖6同。

圖1B表明,中華蹄蓋蕨活性物質的抑菌能力隨提取溫度的升高而增強。差異顯著性分析表明,提取溫度在40、50 ℃時,二者所得活性物質的抑菌效果無顯著差異(P>0.05)。提取溫度在60、70 ℃時,所得活性物質的抑菌能力亦無明顯差別(P>0.05)。當提取溫度為80、90 ℃時,抑菌效果達到最佳且二者所得活性物質的抑菌效果無顯著差異(P>0.05)。分析原因可能為,溫度較低時,反應體系內粒子運動速度較慢,粒子間空隙較小,導致抑菌活性物質無法完全提取出。溫度較高時,反應體系內粒子運動速度較快,粒子間空隙較大,有利于抑菌活性物質充分提出。考慮到本實驗中所用溶劑為乙醇溶液(沸點為78.15～78.5 ℃),當提取溫度為80 ℃時,加入沸石等其他防爆沸措施可妥善控制提取條件。但溫度超出乙醇沸點過多時,反應體系的穩定性較難控制且溫度過高反應條件下抑菌活性物質極易分解,在工業生產中可行性較差。因此根據差異顯著性分析結果(圖1B),選取抑菌效果較優且有顯著差異(P<0.05)的溫度條件(相同抑菌效果情況下以成本較低為選擇標準),即40、60、80 ℃進行后續正交設計。

圖1C表明,中華蹄蓋蕨活性物質的抑菌能力隨提取時間的加大,出現先上升后降低的現象。提取時間6 h,活性物質抑菌能力較差,抑菌直徑為16.02 mm。進一步增加提取時間抑菌能力提高,當時間為10 h時,抑菌能力達到最大(P<0.05),抑菌直徑為25.72 mm。然而,繼續增加提取時間,抑菌能力顯著降低(P<0.05)。

表2 L27(313)正交設計Table 2 L27(313)orthogonal design

注:抑菌圈直徑等于10 mm,表示沒有抑菌效應。

分析原因可能為,較短的提取時間無法充分提取出抑菌活性成分。提取時間較長時(t>10 h),部分活性成分降解,抑菌能力減弱。因此根據差異顯著性分析結果(圖1C),選取三個抑菌效果較優且有顯著差異(P<0.05)的時間條件,即8、10、12 h進行后續正交設計。

2.2 抑菌物質提取工藝優化

本研究采用L27(313)正交設計表對料液比、提取時間、提取溫度三個因素進行正交試驗,以考察各因素及各因素間的相互作用對中華蹄蓋蕨活性物質抑菌效應的影響并分析出最佳提取工藝。表2給出了料液比、提取溫度、提取時間三個影響因素的不同提取條件下中華蹄蓋蕨活性物質對番茄潰瘍病菌的抑菌效果。直觀分析如下,不同提取條件下中華蹄蓋蕨活性物質對番茄潰瘍病菌的抑制效果表現出明顯差異,其抑菌圈直徑數值變動范圍介于18.05～28.73 mm之間,二者的差值為10.68 mm,最大值約為最小值的1.6倍。直觀分析結果說明,中華蹄蓋蕨活性物質抑菌圈直徑大小與其提取條件密切相關。因此,欲獲得具有高效抑菌能力的活性物質,優化提取條件十分重要。極差表示各因素及因素間交互作用對提取液抑菌效果影響的主次順序。極差越大,影響越強,通常起主要作用;極差越小,影響越弱,通常起次要作用;表2表明,料液比(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)所產生的極差值(R)分別為:2.59、7.15和0.65。A×B、A×C、B×C所產生的R值分別為:1.52、0.95、0.38。因而,不同因素和因素間交互作用影響抑菌效應的順序為:B>A>A×B>A×C>C>B×C。

本研究考慮到各因素和因素間的相互作用對中華蹄蓋蕨活性物質抑菌效應的影響。在方差分析過程中,需要把三個因素及其相互作用對應列的均方差與誤差列均方差進行比較,將其中小于2倍誤差列均方差的作用列求得的變差平方和合并進誤差列的變差平方和,重新進行數據處理。如表3,所考查的三個工藝條件因素中,料液比和提取溫度對中華蹄蓋蕨活性物質的抑菌強度均有極顯著影響(F=51.60>F0.01(2,16)=6.23;F=312.90>F0.01(2,16)=6.23),而提取時間對活性物質抑菌強度的影響不顯著(F=2.89F0.05(4,16)=3.01),而提取溫度與提取時間、提取時間與料液比間的交互作用可忽略不計。

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance results

由圖2可知,料液比(A)的最優水平為A1,提取溫度(B)的最優水平為B3。方差分析表明提取溫度和料液比間交互效應對抑菌直徑有顯著影響(表3),進一步確定A、B因素間不同水平如何組合對于獲得高效抑菌活性物質十分重要。因而,將此二者不同水平組合下的抑菌效果做出分析(圖2)。A1B3組合下的抑菌圈直徑平均值為27.65 mm,優于其它水平組合的抑菌效果,為最佳水平組合,與直觀分析結果一致。由于方差分析結果(表3)表明提取時間對中華蹄蓋蕨提取物抑菌強度的影響不顯著,基于經濟、效率、可行等方面考慮最終確定優選工藝條件為A1B3C1,即提取比例1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間8 h,抑菌圈直徑為27.33 mm(表2)。此工藝所得抑菌圈直徑數值僅次于提取比例1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間10 h條件下所得抑菌圈直徑數值(28.73 mm,表2)。然而,差異顯著性分析結果表明二者間并無顯著性差異(圖3,P>0.05)。由于提取時間縮短,可進一步節約成本。故生產上可采用提取比例1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間8 h的工藝進行提取。該提取條件具有操作簡便,效果明顯的特點。

圖2 料液比(A)和提取溫度(B) 相應水平組合下的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of different material to liquid(A) and extraction temperature(B)combinations

圖3 A1B3C1和A1B3C2提取條件下抑菌效果Fig.3 The antibacterial effects under the conditions of A1B3C1 and A1B3C2注:對照為40% DMSO的抑菌效果;抑菌圈直徑 等于10 mm,表示沒有抑菌效應。

2.3 抑菌物質對細胞內活性氧水平的影響

ROS通常指一類細胞內的含氧化合物[19]。當外施藥物、或其他極端環境刺激下[20-21],細菌釋放的ROS量迅速升高,出現氧化應激現象,造成細胞內多數大分子物質損傷,進而達到殺滅細菌的效果[22-24]。

本研究采用DCFH-DA法測定菌體內ROS水平。與傳統ROS測定方法相比,選用該種方法便于實驗操作,效果明顯且能夠降低實驗成本[25]。DCFH-DA的本質為脂溶性探針,具有可穿過細胞膜的特性,且其自身不發熒光。DCFH-DA穿過細胞膜后可產生不能透過細胞膜的2,7-二氯氫化熒光素(DCFH)。圖4反映了不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質對番茄潰瘍病菌細胞內ROS水平的影響。如圖4所示,與對照組相比,在加入中華蹄蓋蕨活性物質濃度分別為0.06、0.12、0.18 mg/mL時,處理組ROS水平無顯著差異(P>0.05)。說明當濃度低于0.18 mg/mL時,番茄潰瘍病菌自身清除活性氧的能力仍可以使菌體內的ROS水平保持平衡。持續升高處理液濃度,當加入活性物質濃度為0.24 mg/mL時,ROS水平顯著(P<0.05)升高。Becerra等[26]研究表明,ROS的大量產生是細菌死亡的重要因素。因此,0.24 mg/mL的中華蹄蓋蕨活性物質可能使番茄潰瘍病菌本身代謝產生的ROS超出了菌體自身清除活性氧能力的范圍,導致細胞積累大量的ROS,損傷細胞內蛋白,達到殺滅細菌的效果。這一研究結果與何芳[24]對苦豆子堿、苦參堿作用于產膜表皮葡萄球菌后菌體內ROS水平變化一致。

圖4 不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質作用后 番茄潰瘍病菌內ROS的水平Fig.4 Reactive oxygen species(ROS)levels in Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis treated with different concentrations of active substances from Athyrium sinense注：對照組中不加入中華蹄蓋蕨活性物質 僅加入體積分數為1%的DMSO，圖5～圖6同。

2.4 抑菌物質對細胞外蛋白含量的影響

細菌細胞內營養物質的選擇性輸送及重要生化代謝的進行都離不開細胞膜的作用和支持[27]。當細胞膜完整性遭到破壞時,其對物質的選擇性運輸也會受到影響。此時,細胞內蛋白質等大分子物質外漏,影響了細菌的正常代謝,從而導致細菌死亡[28]。

不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質處理番茄潰瘍病菌后,泄露于菌體外的蛋白質含量如圖5所示。未經活性物質處理時,檢測到菌體外有極少量的蛋白質存在。持續提高活性物質的濃度,與對照組相比,泄露于菌體外的蛋白質含量顯著(P<0.05)增加。但當處理液濃度為0.06、0.12、0.18 mg/mL時,三個處理組間胞外蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。繼續增加處理液濃度為0.24 mg/mL時,菌體外蛋白質含量達到最大為0.33 mg/mL,且與其他處理組間存在顯著(P<0.05)差異。這一研究結果與劉夢茵等[29]使用烏梅提取物作用于蠟狀芽孢桿菌后胞外蛋白含量變化一致。實驗結果表明隨著活性物質濃度的增加,胞內蛋白質外漏的程度增強,細胞膜通透性變大,影響了細菌的正常代謝。

圖5 不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質作用后 番茄潰瘍病菌細胞外蛋白含量Fig.5 Extracellular protein contents of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis treated with different concentrations of active substances from Athyrium sinense

2.5 抑菌物質對細胞內蛋白含量的影響

胞內蛋白質是細胞結構及酶系的重要組成成分,與核酸、無機離子等其他物質共同組成細胞內容物。細胞內容物的完整性是其維持正常生理代謝的前提[30-31]。圖6反映了中華蹄蓋蕨活性物質對番茄潰瘍病菌細胞內蛋白含量的影響。與對照組相比,經中華蹄蓋蕨活性物質處理后的細胞內蛋白含量顯著(P<0.05)降低。當提取液濃度為0.06、0.12、0.18 mg/mL時,三個處理組間胞內蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。繼續增加處理液濃度為0.24 mg/mL時,菌體外蛋白質含量達到最小,為0.48 mg/mL。說明當低濃度中華蹄蓋蕨活性物質作用于菌體時,就可以使胞內蛋白大量減少。分析其原因,中華蹄蓋蕨活性物質極有可能從兩方面作用于番茄潰瘍病菌的胞內蛋白。一方面,活性物質導致番茄潰瘍病菌細胞膜受到損壞,胞內蛋白質大量外漏。另一方面,活性物質從破壞的細胞膜進入番茄潰瘍病菌內部,直接作用于胞內大分子蛋白質,導致蛋白質含量顯著減少。這一蛋白含量變化結果與張赟彬等[28]對肉桂醛作用下大腸桿菌和金黃色葡萄球菌胞內蛋白含量變化一致。

圖6 不同濃度中華蹄蓋蕨活性物質作用后 番茄潰瘍病菌細胞內蛋白含量Fig.6 Intracellular protein contents in Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis treated with different concentrations of active substances from Athyrium sinense

通過細胞內活性氧含量、細胞內外蛋白質含量的測定,推測中華蹄蓋蕨活性物質可以促使細菌產生的ROS含量劇增,從而破壞菌體自身清除活性氧能力與菌體內產生ROS的平衡。同時過量的ROS也會造成細胞膜、細胞壁的損傷,導致細胞內蛋白質含量減少,細胞外蛋白質含量增加的現象,最終導致番茄潰瘍病菌的死亡。

3 結論

本研究從“食品安全”的指導思想出發,以獲得高效抗番茄潰瘍病菌的植物源活性物質為目的,以中華蹄蓋蕨為材料,在單因素實驗基礎上進行了提取條件的優化及抗菌指標的測定。優化過程中考察了三個與提取抑菌活性物質密切相關的因素,采用考慮到交互作用的多因素多水平正交試驗,最終確定優選提取條件為:料液比1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間8 h,此時的抑菌直徑為27.33 mm。采用優化后的提取條件,有利于提取到中華蹄蓋蕨中更高效的抑菌活性物質,獲取更高的經濟價值。另外,通過測定細胞內活性氧水平、細胞內蛋白質含量、細胞外蛋白質含量三個指標的變化,可推測中華蹄蓋蕨活性物質極有可能通過刺激菌體內ROS的釋放,同時破壞菌體細胞壁,增加細胞膜的通透性,減少細胞內蛋白含量來抑制番茄潰瘍病菌的生長,造成其死亡。實驗結果將為中華蹄蓋蕨活性物質應用于番茄潰瘍病菌的綠色防治及番茄的食用安全提供新的途徑。