鼠李糖乳桿菌GG發酵駝乳與牛乳的發酵特性和降糖活性比較

,2,2,*

(1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院,乳品生物技術 與工程教育部重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018; 2.內蒙古駱駝研究院,內蒙古阿拉善 750306)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病[1]。隨著人們生活水平的提高,糖尿病已經成為危害人類健康的一大疾病。因此嚴格控制血糖水平,是緩解糖尿病的主要措施。目前使用的降糖藥具有一定的療效,但其副作用大、長期服用會對人體自身造成一定的損害[2]。因此,研發各類副作用小、能兼顧治療并發癥的藥物,特別是天然物質在治療糖尿病方面受到日益重視[3]。

駝乳營養結構獨特,易于消化吸收,富含蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素和人體所需的礦物質等營養成分,具有很高的營養和保健價值[4]。在輔助治療糖尿病方面也格外突出,其降糖因子如乳鐵蛋白、免疫球蛋白等保護性蛋白及維生素C等均高于牛乳[5-6]。已有研究發現,駝乳能顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平,會明顯降低其空腹血糖[7-9]。Sahani等[10]也對駝乳的口服降血糖活性進行了對照研究，發現駝乳喂養的大鼠與牛乳喂養的大鼠相比,平均血糖水平顯著降低,表明駝乳對糖尿病的輔助治療有一定的作用。

乳中發揮作用的主要物質是生物活性肽,乳源性生物活性肽是以乳蛋白為原料經過分離純化得到的具有特殊生物活性的一類物質[11]。目前主要采用酶解和發酵的方法制備乳源性生物活性肽。發酵法是制備生物活性肽最傳統的方法,因其獨特的蛋白酶系統,可制備功能豐富的生物活性肽,受到人們的廣泛關注[12]。目前,多采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌等乳酸菌發酵,其中的鼠李糖乳桿菌GG能夠耐受并定植于動物消化道,可調節腸道菌群、排除毒素、提高機體免疫力等功能特性,受到人們的青睞[13]。已有研究表明,鼠李糖乳桿菌發酵動物乳,可產生具有降壓、抗氧化等生物活性的肽[14]。因此,本試驗預采用耐酸、耐氧、定植力強及功能性豐富的鼠李糖乳桿菌GG發酵駝乳和牛乳,通過一系列的發酵乳指標及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究,比較不同發酵乳的發酵性能和體外降糖活性,以期找到一種輔助治療糖尿病的天然物質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙峰駝乳 內蒙古阿拉善盟阿拉善右旗養駝戶提供;牛乳 內蒙古呼和浩特市養牛戶提供;鼠李糖乳桿菌GG(ATCC7469)、MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;1,4-二巰基蘇糖醇(1,4-Dithiothreitol,DTT,純度為99%)、α-淀粉酶(40000 U/g)、可溶性淀粉、DNS試劑 北京索萊寶科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(10000 U/g)、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS) 美國Sigma公司;對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-Nitrophenylα-D-glucopyranoside,pNPG) 上海源葉生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(o-Phthalaldehyde,OPA,純度為97%) 天津市光復精細化工研究所;其他試劑 均為分析純。

FE28pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;5810R高速冷凍離心機 德國艾本德有限公司;BJ-2CD凈化工作臺 上海博訊實業有限公司;GHP-9270隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限責任公司;Synergy H1多功能微孔板檢測儀 美國伯騰實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化培養 鼠李糖乳桿菌GG于脫脂乳中-80 ℃保存備用,按2%的接種量接種到MRS肉湯培養基中活化傳代,在37 ℃恒溫靜置培養24 h,直至第三代。為了保持乳酸菌的活性,每周進行一次活化培養。

取三代鼠李糖乳桿菌GG培養液,在4000 r/min,4 ℃條件下離心15 min,收集菌體,用0.85%生理鹽水洗滌2次后,混勻制成供試菌懸液(>8.00 lg CFU/mL),以供后續試驗使用。

1.2.2 鼠李糖乳桿菌GG生長曲線的測定 活化培養的二代鼠李糖乳桿菌GG接種到MRS肉湯培養基中,37 ℃恒溫培養48 h,每隔1 h采樣。取200 μL上述混勻的接種液加入到檢測孔板中,做三個重復孔,在600 nm處測定吸光度[15]。以發酵時間為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制鼠李糖乳桿菌GG生長曲線。

1.2.3 原料乳預處理 原料乳(駝乳和牛乳)經離心脫脂(6000 r/min,30 min,4 ℃),并巴氏消毒殺菌(90 ℃,10 min),冷卻至37 ℃備用。

1.2.4 發酵乳的制備 按3%的接種量將1.2.1中得到的菌懸液接種于處理好的原料乳中,在37 ℃下靜置培養24 h。取出后置于4 ℃下儲藏28 d,并在不同發酵時間(3、6、9、12、15、18、21和24 h)和儲藏時間(0、7、14、21和28 d)采樣。

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 pH測定 pH直接用FE28 pH計測定。

1.2.5.2 滴定酸度測定 取10 g發酵乳于三角瓶中,加入20 mL蒸餾水,滴入2～3滴酚酞指示劑,用濃度為0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定,不斷輕微搖動,直至微紅色在30 s內不消失為止[16]。發酵乳的滴定酸度按下面公式計算。

式中:c表示標準NaOH的濃度,mol/L;v表示滴定所消耗標準NaOH的體積,mL;m表示樣品質量,g;0.1表示酸度理論定義NaOH的摩爾濃度,mol/L。

1.2.5.3 乳酸菌活菌數測定 稱取25 mL發酵乳放于225 mL無菌生理鹽水中,充分振搖后形成均勻的稀釋液。用無菌生理鹽水進行梯度稀釋。取合適稀釋度的溶液1 mL于無菌培養皿中,倒入50 ℃左右的滅菌MRS瓊脂培養基,立即混勻,待凝固后倒置,37 ℃培養(48±1) h。觀察菌落生長情況,并計數,每個梯度重復3次取平均值[17]。

1.2.6 發酵乳水溶性提取物的制備 發酵乳經離心分離(8000 r/min,15 min,4 ℃),取上清液于0.45 μm過濾器過濾,置于-20 ℃保存。

1.2.7 發酵乳蛋白質水解活性的測定

1.2.7.1 OPA試劑的配制 200 mg十二烷基硫酸鈉,7.62 g四硼酸鈉,160 mg鄰苯二甲醛,4 mL乙醇和176 mg 1,4-二巰基蘇糖醇定容到200 mL,避光冷藏。

1.2.7.2 酪氨酸標準曲線的繪制 將酪氨酸配制成不同濃度(0、100、200、300、400和500 μg/mL)的標準溶液,分別取400 μL標準溶液加入3 mL的OPA試劑,漩渦混勻5 s,在室溫下反應2 min后,測定340 nm處的吸光度。以酪氨酸濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制酪氨酸標準曲線。所得標準曲線方程為y=0.0018x+0.005,R2=0.997。

1.2.7.3 蛋白質水解活性的測定 準確吸取1.2.6所得的發酵乳水溶性提取物400 μL,加入3 mL的OPA試劑,漩渦混勻5 s,室溫下反應2 min后,在340 nm處測定其吸光度。對應酪氨酸標準曲線得出相當于酪氨酸的量,以此反映蛋白質水解活性[18]。

1.2.8α-淀粉酶抑制活性的測定 吸取1.2.6所得的發酵乳水溶性提取物100 μL及1 U/mL的α-淀粉酶(用pH6.8,0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制)100 μL于試管中,混勻后于37 ℃恒溫反應5 min,再加入250 μL 1%淀粉溶液(用pH6.8,0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制),混勻后于37 ℃恒溫反應5 min,加入200 μL的DNS試劑,反應液于沸水浴中加熱15 min后取出,并于冰水浴中迅速冷卻,再加入2 mL蒸餾水,于540 nm處測定吸光度,記作A樣品。以磷酸緩沖液代替樣品,其它條件同A樣品,記作A對照。以磷酸緩沖液代替酶,其它條件同A樣品,記作A空白[19]。

抑制率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

1.2.9α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 吸取1.2.6所得的發酵乳水溶性提取物50 μL及1 U/mL的α-葡萄糖苷酶(用pH6.8,0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制)100 μL于試管中,混勻后于37 ℃恒溫反應10 min,加入50 μL 5 mmoL/L的pNPG溶液(用pH6.8,0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制),混勻,37 ℃恒溫反應30 min,再加入0.1 moL/L的Na2CO3溶液1 mL,并于400 nm處測定吸光度,記作A樣品。以磷酸緩沖液代替樣品,其它條件同A樣品,記作A對照。以磷酸緩沖液代替酶,其它條件同A樣品,記作A空白[19]。

抑制率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

1.3 數據處理

所得數據均用SPSS 16.0和Microsoft Excel 2010進行數據處理、統計分析和作圖。各組實驗均重復三次,以平均值(Mean)±標準偏差(Standard deviation)來表示,采用ANOVA進行鄧肯氏(Duncan’s)差異分析,以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌GG的生長曲線

鼠李糖乳桿菌GG在0～48 h的生長曲線,如圖1所示。

圖1 鼠李糖乳桿菌GG生長曲線Fig.1 The growth curve of Lactobacillus rhamnosus GG

由圖1可知,鼠李糖乳桿菌GG在培養2 h后進入生長對數期。在2～14 h內,菌液OD600值迅速升高,隨后逐漸進入穩定期。當培養至24 h時,菌液的OD值出現最高值,其原因可能是隨著鼠李糖乳桿菌GG的生長繁殖,代謝產物不斷積累,到24 h時吸光度達到最大1.64±0.01。因此,鼠李糖乳桿菌在24 h時活力較強,適合接種于原料乳中,并且具有良好的發酵特性。

2.2 發酵指標測定結果

2.2.1 發酵乳的pH和滴定酸度 如圖2可知,隨著發酵時間的增加,發酵駝乳和發酵牛乳二者的pH都呈下降的趨勢,在發酵24 h時,達到最低。如圖3,在冷藏期間由于發酵乳的后酸化現象,導致冷藏28 d時達最低,而兩種發酵乳的滴定酸度(圖4、圖5)呈上升的趨勢,冷藏28 d時達最高。可以看出pH與滴定酸度存在極強的負相關(發酵駝乳r=-0.97,發酵牛乳r=-0.96，數據表未顯示，下文同)。可能的原因是隨著鼠李糖乳桿菌GG的生長繁殖,分解乳糖產生乳酸的效率增加,代謝產物(如乳酸等)不斷積累,整個發酵體系的酸度也隨之升高。冷藏后,發酵乳出現后熟現象,酸度繼續上升[20]。發酵駝乳的pH較發酵牛乳低,滴定酸度較發酵牛乳高,這可能是由于原料乳成分不同所致。研究表明,駝乳成分不同于牛乳,其蛋白質、乳糖、干物質和灰分等成分含量均高于牛乳[21]。駝乳的蛋白質種類也十分豐富,還有一些短肽、氨基酸和維生素等生長因子含量較高。可認為是駝乳的營養成分營造出了利于鼠李糖乳桿菌GG生長的環境,使其更易生長繁殖,發酵駝乳因此能產生更多的有機酸。

圖2 不同發酵時間發酵乳的pHFig.2 pH of fermented milk at different fermentation time

圖3 不同儲藏時間發酵乳的pHFig.3 pH of fermented milk at different storage time

圖4 不同發酵時間發酵乳的滴定酸度Fig.4 Titratable acidity of fermented milk at different fermentation time

圖5 不同儲藏時間發酵乳的滴定酸度Fig.5 Titratable acidity of fermented milk at different storage time

2.2.2 發酵乳的活菌數 發酵乳中乳酸菌的活菌數一方面反映了發酵乳的保健功效,另一方面反映了發酵乳的儲藏性能,對于發酵乳是一個重要的參考指標[22-23]。根據圖6的發酵曲線可知,鼠李糖乳桿菌GG在發酵期間利用原料乳中的營養物質促進自身的生長繁殖,使得兩種發酵乳的活菌數整體都呈上升的趨勢。圖7可以看出,隨著儲藏時間的不斷延長,發酵乳酸度過高,鼠李糖乳桿菌GG利用的氮源等一些生長因子也消耗殆盡,已不利于菌體的生長,使菌體逐漸衰亡;也可能是鼠李糖乳桿菌GG是嗜溫性細菌,在4 ℃的儲藏條件下處于冷應激狀態,使得儲藏期間的活菌數一直下降[24]。但兩種發酵乳的活菌數在儲藏期間仍大于8.00 lg CFU/mL,符合國標中發酵乳活菌數的要求,這也與Moslehishad等[14]研究的結果所一致。

圖6 不同發酵時間發酵乳的活菌數Fig.6 Bacterial counts of fermented milk at different fermentation time

圖7 不同儲藏時間發酵乳的活菌數Fig.7 Bacterial counts of fermented milk at different storage time

經過相關性分析可以發現,發酵乳的活菌數與pH有一定的關系,表現為極強的負相關(發酵駝乳r=-0.93,發酵牛乳r=-0.92)。發酵期間原料乳營養物質豐富,鼠李糖乳桿菌GG處于增長期,導致在該時期鼠李糖乳桿菌GG生長繁殖旺盛,活菌數不斷增加,pH不斷下降。在儲藏期間,由于外界溫度和發酵乳酸度的變化,影響了鼠李糖乳桿菌GG的生長,使其增殖受到抑制[25],活菌數和pH呈下降的趨勢。

2.3 發酵乳的蛋白質水解活性

蛋白質水解活性是表明發酵產品健康作用的初步指標,OPA法可以評估發酵產品中的游離氨基酸和小肽的含量[26]。酪氨酸當量越高,表明水解的程度也越大。乳酸菌可提供幾種蛋白質水解酶,如蛋白酶、肽酶和氨基肽酶等,可提高乳中的蛋白水解程度[27]。由圖8、圖9所示,在整個發酵和儲藏期間,酪氨酸當量顯著增加,并高于未發酵乳,表明蛋白質水解的程度也不斷增加。說明鼠李糖乳桿菌GG是一種蛋白水解菌株,并且隨著時間的延長,鼠李糖乳桿菌GG不斷生長繁殖,代謝產物不斷積累,使得蛋白水解活性增加[28]。在發酵和儲藏期間,發酵駝乳的酪氨酸當量基本都高于發酵牛乳,表明發酵駝乳的蛋白質水解活性明顯高于發酵牛乳,這與Shori等[29]研究結果相一致。導致這個結果的原因一方面可能由于駝乳中蛋白質含量高,使得酶水解的底物含量變高;另一方面可能是由于鼠李糖乳桿菌GG所產生的蛋白水解酶與駝乳中的酪蛋白作用效果更好,使得蛋白質水解活性提高。

圖8 不同發酵時間發酵乳的蛋白質水解活性Fig.8 Proteolytic activity of fermented milk at different fermentation time注:不同小寫字母表示相同乳在不同時間下差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示不同乳在同一時間下差異顯著(P<0.05)。不同字母表示差異顯著;相同字母表示差異不顯著(P>0.05);圖9～圖13同。

圖9 不同儲藏時間發酵乳的蛋白質水解活性Fig.9 Proteolytic activity of fermented milk at different storage time

發酵駝乳和發酵牛乳的OPA值與滴定酸度呈極強的正相關(發酵駝乳r=0.96,發酵牛乳r=0.92),可能是由于菌株發酵原料乳提高了蛋白質水解活性和乳糖代謝所致。此外,由于相對較高的蛋白質水解活性,使得發酵后的駝乳生物活性提高。

研究發現,蛋白質水解活性與鼠李糖乳桿菌GG的生長繁殖有密切關系。在發酵過程中,隨著鼠李糖乳桿菌GG的生長繁殖,蛋白質水解活性也不斷增加。在儲藏時期,發酵駝乳中酪蛋白水解和多肽繼續分解,酪氨酸當量繼續升高。發酵牛乳在儲藏14 d前,蛋白質水解活性增加,而在儲藏14 d后,由于鼠李糖乳桿菌GG在低溫和酸脅迫的條件下,使得鼠李糖乳桿菌GG的代謝活動發生改變,酪蛋白降解和多肽分解釋放氨基酸的速度減慢,表現為酪氨酸當量無顯著差異(P>0.05)。

2.4 發酵乳的降糖活性

抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性是體外測定降糖活性最常用的指標,二者是通過阻礙食物中的淀粉及其他碳水化合物的消化和分解,選擇性的減少糖分攝取,從而降低血糖水平[30-31]。因此,抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性在防治糖尿病方面具有巨大的潛力。從圖10、圖11整體看出,發酵駝乳和發酵牛乳都具有較強的α-淀粉酶抑制活性,并且都高于未發酵的原料乳,這是由于未經發酵原料乳中的蛋白質沒有被鼠李糖乳桿菌GG產生的蛋白酶分解,產生有效的肽段,導致原料乳本身的α-淀粉酶抑制活性較低。除未發酵的原料乳外,發酵駝乳和牛乳在發酵和儲藏時期的抑制率都大于70.00%,說明時間不是影響降糖活性的因素,其原因可能是鼠李糖乳桿菌GG是一種蛋白水解菌株,使得乳中的蛋白質水解生成降糖活性肽,也可能是鼠李糖乳桿菌GG本身或其產生的代謝產物就具有一定的降糖活性。在發酵24 h時,菌活力最高時,α-淀粉酶抑制率達到最高,表明鼠李糖乳桿菌GG的生長影響著發酵乳的降糖活性。在發酵24 h時,鼠李糖乳桿菌GG代謝產物的積累有益于降糖成分的產生,使得降糖活性最高。

圖10 不同發酵時間發酵乳的α-淀粉酶抑制率Fig.10 α-Amylase inhibition rate of fermented milk at different fermentation time

圖11 不同儲藏時間發酵乳的α-淀粉酶抑制率Fig.11 α-Amylase inhibition rate of fermented milk at different storage time

圖12 不同發酵時間發酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.12 α-Glucosidase inhibition rate of fermented milk at different fermentation time

圖12、圖13表現出極低的α-葡萄糖苷酶抑制率,這可能與α-葡萄糖苷酶抑制活性與疏水氨基酸密切相關,從而導致水解液抑制活性偏低。并且圖12中駝乳和牛乳發酵9 h前還出現了負抑制率,表明在水解過程中,蛋白質結構發生變化,分解成無效的小分子非蛋白類物質,如小分子肽段和單個氨基酸,對抑制率產生了負面的影響。發酵駝乳的α-葡萄糖苷酶抑制率都普遍高于發酵牛乳,這可能與原料乳有關。駝乳本身就含有降糖活性因子,具有較高降糖活性[5-6],表現出駝乳的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率高于牛乳。圖13中,發酵駝乳在儲藏7 d后的α-葡萄糖苷酶抑制率呈下降趨勢,可以解釋為水解進一步分解成無活性肽和氨基酸[32]。Ayyash等[19]研究表明蛋白質水解活性與生物活性有一定的關系,而2.3中蛋白質水解程度顯著增加(P<0.05),降糖活性無太大變化,說明蛋白質水解的程度與降糖活性沒有直接的關系。

圖13 不同儲藏時間發酵乳的α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.13 α-Glucosidase inhibition rate of fermented milk at different storage time

3 結論

從鼠李糖乳桿菌GG生長曲線可以看出,24 h作為本文駝乳和牛乳的發酵時間。發酵結果發現,鼠李糖乳桿菌GG在駝乳中生長繁殖更旺盛,其酸度更高,活菌數更多,蛋白質水解活性更高。pH、滴定酸度、鼠李糖乳桿菌GG活菌數和蛋白質水解活性存在一定的內在聯系。降糖活性方面,發現鼠李糖乳桿菌GG發酵的駝乳和牛乳都具有較高的降糖活性,且發酵駝乳的降糖活性稍高于發酵牛乳。因此由鼠李糖乳桿菌GG發酵乳和駝乳都具有開發成輔助降糖的保健食品或藥品的潛力,二者都為輔助治療糖尿病開辟一條新的道路。但本文只對發酵乳的降糖活性進行了體外測定,缺乏體內降糖活性的驗證,并且對降糖的機制未給出確定的解釋,還需進一步研究探索。