近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化活性及其穩定性

戴梓茹1,,禤日翔,孔 艷3,梁慶喜,梁冬萍,吳遠清

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室,廣西欽州 535011; 2.北部灣大學食品工程學院,廣西欽州 535011; 3.廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

近江牡蠣俗稱蠔、海蠣子,是一種高蛋白、低脂肪的食品。其營養價值高并含有大量的生物活性物質[1]。近江牡蠣被冠以“海洋牛奶”的美稱,具有其獨特的保健功能和藥用價值[2-3]。牡蠣養殖業快速的發展,使得牡蠣產量迅速增加,導致牡蠣的市場價格下跌[4],因此,高效利用牡蠣資源具有一定的商業意義。

本文以近江牡蠣為原材料,經過酶解法獲得近江牡蠣糖胺聚糖,采用清除·OH和DPPH·法研究近江牡蠣糖胺聚糖的·OH和DPPH·清除能力,并探討近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化活性及穩定性,從而為保健食品和藥品行業的開發利用提供相關的理論基礎和參考依據,為充分利用近江牡蠣的生態資源提供可靠的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣(Conchaostrea) 采集于欽州茅尾海海域,樣品采集后冰盒中冷藏,并迅速運回實驗室,去殼,清洗干凈后-20 ℃凍藏,備用;胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶 5000 U/g,國藥集團化學試劑有限公司;胃蛋白酶(250000 U/g) 美國西格瑪公司;磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4) 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 海金穗生物科技有限公司;95%乙醇 AR,成都市科隆化學品有限公司;鄰二氮菲 AR,廣東光華科技股份有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) AR,廣東省化學試劑工程技術研究開發中心;硫酸亞鐵(FeSO4) AR,天津市大茂化學試劑廠;過氧化氫(H2O2) AR,山東顧澎化工有限公司;硅藻土 AR,寧波鼎創新材料有限公司;活性炭 AR,河南瑞思環保科技有限公;濃硫酸 98%,西隴科學股份有限公司。

FD5-series冷凍干燥機 SIM公司;ZHSY-50WS恒溫水浴振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司;TGL20臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司;R-300EL旋轉蒸發儀 瑞士步琪有限公司;V-1800PC分光光度計 上海美普達儀器有限公司;XS40精密分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 近江牡蠣糖胺聚糖制品的制備 參考胡雪瓊等[19]的方法制備近江牡蠣糖胺聚糖:將新鮮的近江牡蠣去殼、清洗、瀝干。將近江牡蠣全臟器與純水按質量比1∶1攪拌混合,過膠體磨得到牡蠣漿液,調節pH至7.0,先加入1.0%的枯草桿菌中性蛋白酶混勻,放置在50 ℃恒溫水浴振蕩器酶解5 h后,90 ℃滅酶15 min。再調節pH至7.8,加入1.0%(質量分數)胰蛋白酶充分混勻后,在50 ℃下酶解5 h,最后經90 ℃滅酶15 min。將通過酶解后的近江牡蠣溶液制成3%水解液,加入1.0%(W/V)硅藻土與1.0%(W/V)活性炭混合物,65 ℃恒溫水浴45 min,利用布氏漏斗進行抽濾,再離心取上清液。利用等電點除雜蛋白法精制,經0.45 μm有機濾膜抽濾后利用旋轉蒸發儀進行濃縮處理,最后利用冷凍干燥得到近江牡蠣糖胺聚糖。

1.2.2 總糖和糖胺聚糖的測定 總糖的測定參考苯酚-硫酸法[20],準確稱葡萄糖標準品20 mg溶解后定容至500 mL容量瓶中,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 mL葡萄糖標準品溶液至帶塞的試管中,各以蒸餾水補至2.0 mL,然后加入6% 苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL,靜置10 min,搖勻冷卻,室溫放置20 min以后于490 nm測光密度,以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白,橫坐標為葡萄糖標準品濃度,縱坐標為吸光度值,得標準曲線:y=3.0476x+0.0073(R2=0.9969)。將近江牡蠣糖胺聚糖稀釋后,取2 mL按上述步驟操作測吸光度值,參照總糖標準曲線計算近江牡蠣糖胺聚糖的總糖含量。

糖胺聚糖含量的測定參照阿利新藍比色法[3]繪制標準曲線。在比色管中分別加入0.2 mL的已經配置好的100、200、400、600 μg/mL的糖胺聚糖標準液(肝素鈉),用0.1 mL水按同樣顯色操作為空白,在各管中精確加入1.5 mL的阿利新藍染液,混勻。靜置10 min后,于480 nm波長處測定吸光度值,以肝素鈉濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制糖胺聚糖標準曲線為y=0.1332x+0.5134(R2=0.9965)。將樣品液0.2 mL按上述步驟測定其吸光度值,通過標準曲線求出樣品中糖胺聚糖的含量。

1.2.3 近江牡蠣糖胺聚糖體外抗氧化活性研究

1.2.3.1 ·OH清除率的測定 參考Li等[21]的方法測定羥基自由基(·OH)清除力(鄰二氮菲法)。

分別稱取近江牡蠣糖胺聚糖樣品2.00 g,用水定容至100 mL,配制成20 mg/mL的化合物母液,繼而以蒸餾水稀釋制成2、4、6、8、10、12 mg/mL的一系列樣品待測液。具體測定方法如下:

樣品管:取0.6 mL鄰二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH7.4)混勻后,加入0.6 mL樣品溶液及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),再次混勻后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),充分混勻后加入0.8 mL H2O2(0.1%),搖勻后于37 ℃保溫1 h,536 nm處測吸光值計為As。

損傷管:以去離子水代替樣品,其余步驟同樣品管,所測吸光值計為Ad。

未損傷管:以去離子水代替H2O2,其余步驟同損傷管,所測吸光值計為Au。

樣液對·OH清除率表示為:

1.2.3.2 DPPH·清除能力 DPPH法采用Bao等[22]的方法并稍作修改。分別稱取近江牡蠣糖胺聚糖樣品2.00 g,用水定容至100 mL,配制成20 mg/mL的化合物母液,繼而以蒸餾水稀釋制成2、4、6、8、10、12、14、16 mg/mL的一系列樣品待測液。分別往試管中加入對應濃度樣品待測液1 mL,加入1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L,溶于無水乙醇),振蕩混勻,室溫避光反應 30 min后,在517 nm處測其吸光值(AS),以1 mL無水乙醇加入1 mL蒸餾水調零,1 mL樣品待測液與1 mL無水乙醇混合物于517 nm處所測吸光記為Ac,1 mL蒸餾水與1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合后再測定波長的吸光值記為A0。樣液對DPPH·的清除能力表示為:

1.2.4 近江牡蠣糖胺聚糖穩定性研究 用蒸餾水配制濃度為6 mg/mL的近江牡蠣糖胺聚糖樣品溶液100 mL,充分溶解后靜置待用,抗氧化穩定性研究參照孟良玉等[23]的方法并稍作修改。

1.2.4.1 溫度對糖胺聚糖穩定性的影響 各取樣品液2 mL,分別在常溫(25 ℃,對照)、40、60、80、100 ℃下處理1 h,取出放冰上冷卻,用蒸餾水定容至5 mL,分別進行·OH和DPPH·清除率的測定。

1.2.4.2 pH對糖胺聚糖穩定性的影響 各取樣品液4 mL,用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液將pH分別調整至2.0、3.5、4.0、6.0、8.0、10.0,不調節pH組為對照試驗,用蒸餾水定容至5 mL,在室溫靜置1 h,分別進行·OH和DPPH·清除率的測定。

1.2.4.3 紫外照射對糖胺聚糖穩定性的影響 各取樣品液4 mL,在紫外燈下分別照射時長為0(對照)、30、60、90、120、150 min,分別進行·OH和DPPH·清除率的測定。

1.2.4.4 NaCl濃度對糖胺聚糖穩定性的影響 各取樣品液4 mL,分別加入2 mL濃度為1、2、3、4、5 mmol/L的NaCl溶液,同時加2.0 mL蒸餾水做對照,充分混勻放置15 min,分別進行·OH和DPPH·清除率的測定。

1.2.4.5 體外模擬胃腸道消化對糖胺聚糖穩定性的影響 用蒸餾水配制濃度為6 mg/mL的近江牡蠣糖胺聚糖樣品溶液25 mL,取4 mL樣品定容至5 mL,記做未處理液A。取8 mL樣液用1 mol/L HCl調節pH至2.00,加入胃蛋白酶1.00 mg(20.00 mg/g),37 ℃恒溫水浴90 min。用1 mol/L NaOH調節pH至7.50,定容至10 mL,收集一半反應液,記為消化液B,冷卻至室溫,備用。向另一半反應液中加入胰蛋白酶1.00 mg(40.00 mg/g),37 ℃恒溫水浴120 min,90 ℃水浴15 min滅酶活,定容至5 mL,記為消化液C,冷卻至室溫。分別以未處理液A、消化液B和消化液C為待測液,進行·OH和DPPH·清除率的測定。

1.3 數據統計

2 結果與分析

2.1 近江牡蠣糖總糖和糖胺聚糖含量

依據1.2.2中總糖(以葡萄糖為標準品)、糖胺聚糖(以肝素鈉為標準品)的各標準曲線公式,計算得出近江牡蠣糖胺聚糖的總糖含量為55.99%,糖胺聚糖含量為49.05%。

2.2 近江牡蠣糖胺聚糖體外抗氧化性研究

近江牡蠣糖胺聚糖DPPH·和·OH的清除率如圖1所示。糖胺聚糖對DPPH·清除率有非常強的清除作用,其清除能力與質量濃度成正比,在樣品濃度為2.00～12.00 mg/mL時隨著濃度的升高,DPPH·清除率逐漸升高,但當樣品濃度高于14.00 mg/mL時,隨濃度的增加,清除率趨于穩定,此時近江牡蠣糖胺聚糖對DPPH·的清除率為79.15%。隨著樣品濃度增加,·OH清除率逐漸增強。當樣品濃度為12 mg/mL時,·OH清除率達到了100.00%。結果表明近江牡蠣糖胺聚糖具有較好的體外抗氧化活性。綜合分析近江牡蠣糖胺聚糖對·OH清除能力和DPPH·清除能力,最終選取近江牡蠣糖胺聚糖濃度為6 mg/mL進行近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化活性的穩定性研究分析。

圖1 近江牡蠣糖胺聚糖對自由基的清除效果Fig.1 Scavenging effect on free radicals of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.1 近江牡蠣糖胺聚糖穩定性研究分析 根據抗氧化活性·OH清除能力和DPPH·清除能力兩個指標方法分析探討近江牡蠣糖胺聚糖在不同溫度、pH、紫外線照射時間、Na+濃度以及體外模擬腸胃道消化條件下的抗氧化能力的穩定性。

2.2.2 溫度對糖胺聚糖穩定性的影響 由圖2可知,溫度對于近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化能力有一定的影響(對照組為常溫),隨著溫度升高,對·OH清除能力及DPPH·的清除能力均呈現出下降的趨勢。在溫度為40～80 ℃時,與對照組相比,DPPH·清除率顯著下降(P<0.05),·OH清除能力有所下降,但其變化無顯著性差異(P>0.05),但仍保持較高的抗氧化能力,溫度為100 ℃時,·OH及DPPH·清除率顯著下降(P<0.05),分別為23.63%和15.93%。左勇等[24]研究發現肝素鈉的效價隨溫度升高而降低。牡蠣糖胺聚糖是一類肝素鈉含量較高的多糖物質,抗氧化活性受溫度影響較大。綜合考慮,近江牡蠣糖胺聚糖在40～80 ℃時的抗氧化作用效果最好,可以依據此特點設定其抗氧化作用條件。

圖2 溫度對近江牡蠣糖胺聚糖穩定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis注:不同大寫字母表示·OH清除率有顯著性差異(P<0.05),不同小寫字母表示DPPH·清除率 有顯著性差異(P<0.05);圖3～圖6同。

2.2.3 pH對糖胺聚糖穩定性的影響 pH對近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化活性影響如圖3所示。隨著pH的增大,近江牡蠣糖胺聚糖對·OH和DPPH·清除率顯著降低(P<0.05)(對照組pH為2.21),在極酸環境(pH=2.00)下,·OH和DPPH·清除率分別為57.17%和54.00%,pH為4.00時，·OH和DPPH·清除率分別為33.65%和47.43%,pH為10.00時，·OH和DPPH·清除率下降為5.64%和4.42%,原因可能是糖胺聚糖也稱酸性多糖,是陰離子多糖鏈呈酸性,在酸性條件下結構穩定,堿性條件下結構被破壞。從圖3中可以看出,當pH在2～8時,隨著pH的增大,牡蠣糖胺聚糖對DPPH·和·OH的清除率呈現的下降趨勢具有顯著性差異(P<0.05),當pH在8～10時,其下降趨勢無顯著性變化(P>0.05),對兩種自由基都達到相對較低的清除率,其綜合分析可以得出,近江牡蠣糖胺聚糖在堿性條件下抗氧化性質不穩定,在偏酸環境下抗氧化作用強,且穩定,因此在生產或保存近江牡蠣糖胺聚糖時,應控制在強酸環境下,以發揮其最強的抗氧化效果。

圖3 pH對近江牡蠣糖胺聚糖穩定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.4 紫外線照射對糖胺聚糖穩定性的影響 紫外線照射對近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化活性的影響如圖4所示(對照照射時長為0 min)。隨著紫外線照射時間的增加,近江牡蠣糖胺聚糖對DPPH·的清除能力緩慢減弱,照射時間在0～150 min時,對 DPPH·的清除無顯著性變化(P>0.05),在照射時間為150 min時,清除率降到最低,為42.90%,此時,糖胺聚糖仍具有較強的抗氧化活性。隨著紫外線照射時間的增加,糖胺聚糖對·OH的清除能力呈現出緩慢上升并在照射時間≥60 min時,對·OH的清除率無顯著性變化(P>0.05),趨于穩定,清除能力最高達到76.84%。因此,紫外線照射條件下,糖胺聚糖能保持較好的抗氧化活性。

圖4 紫外線照射時間對近江牡蠣糖胺聚糖穩定性的影響Fig.4 Effect of ultraviolet irradiation time on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.5 氯化鈉對糖胺聚糖穩定性的影響 NaCl對近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化能力影響如圖5所示(對照為蒸餾水)。添加濃度分別為1～5 mmol/L的NaCl溶液后,近江牡蠣糖胺聚糖對 DPPH·清除率顯著下降(P>0.05),但仍保持較強抗氧化活性,且添加不同濃度NaCl對DPPH·清除率影響無顯著差異。添加NaCl后,·OH清除率與對照組無顯著差異(P>0.05)。說明了Na+的存在,近江牡蠣糖胺聚糖仍保持較好的抗氧化活性。

圖5 氯化鈉對近江牡蠣糖胺聚糖穩定性的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.6 體外模擬胃腸道消化對糖胺聚糖穩定性的影響 體外模擬胃腸道消化對糖胺聚糖抗氧化活性的影響如圖6所示。在體外模擬胃腸道消化后,近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化活性顯著下降(P<0.05)。DPPH·清除能力在胃腸道消化后,消化液B與未處理液A無顯著差異,腸道消化液C 的DPPH·清除率顯著下降(P<0.05),但具有一定的清除能力(26.43%)。與未處理液A相比,在胃腸道消化后消化液B和消化液C的·OH清除能力顯著下降(P<0.05),消化液B和消化液C無顯著差異,仍具有一定的·OH清除能力,分別為12.06%、10.07%。近江牡蠣糖胺聚糖抗消化能力較弱,在加工過程中可經過穩定前處理以更好發揮其抗氧化活性。

圖6 體外模擬胃腸道消化 對近江牡蠣糖胺聚糖穩定性的影響Fig.6 Effect of gastrointestinal digestion on stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis in vitro

3 結論

本研究以近江牡蠣全臟器為原料,通過酶解法得到近江牡蠣糖胺聚糖,通過測定·OH清除率和DPPH·清除率探討其抗氧化能力及其穩定性。結果表明,近江牡蠣糖胺聚糖具有較好的體外抗氧化活性,并且在溫度為40～80 ℃ 時,偏酸環境,紫外線照射以及含有Na+條件下,其抗氧化作用都能夠都維持在一個較穩定的狀態(DPPH·清除率>22.92%,·OH清除率>27.34%)。但是近江牡蠣糖胺聚糖抗消化能力較弱,在加工過程中可經過穩定前處理以更好發揮其抗氧化活性。近江牡蠣糖胺聚糖純度不高或成分較為復雜等原因在一定程度上影響了其總體抗氧化能力。若能進一步通過超濾、色譜分析等方法進行分離純化,可能會得到抗氧化活性更強的近江牡蠣糖胺聚糖。對近江牡蠣糖胺聚糖的體外抗氧化活性及穩定性的研究,為進一步研究開發和利用近江牡蠣提供了相關的理論基礎和參考依據。