長裙竹蓀多肽抗氧化及免疫調節作用

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(1.四川省農業科學院生物技術核技術研究所,四川成都 610061; 2.阿壩州林業科學技術研究所,四川汶川 623000; 3.四川師范大學生命科學學院,四川成都 610068)

竹蓀(Dictyophoraindusiata),隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)、腹菌綱(Gasteromycetes)、鬼筆目(Phallales)、鬼筆科(Phallaceae)、竹蓀屬(Dictyophora),其營養豐富、味道鮮美,是享譽世界的美味食用菌。竹蓀具有滋補強壯、益氣補腦、寧神健腦的功效[1]。現代醫學研究發現,竹蓀浸提液含有天然抑菌物質,能夠有效抑制食源性致病菌增殖[2];竹蓀富含的多酚能有效清除活性氧自由基,具有優良的抗氧化活性[3];竹蓀多糖則具有抗氧化[4]、強化免疫、抑制腫瘤的作用[5],能夠有效誘導小鼠腹水瘤S180細胞凋亡[6],抑制肺癌A549細胞與宮頸癌Hela細胞的增殖[7]。

免疫調節肽是指具有增強免疫功能的一類生物活性肽,其作用對象多為巨噬細胞,通過增強體內巨噬細胞吞噬功能,調節細胞因子的分泌以及促進淋巴細胞的增殖來起作用[8]。免疫調節肽能夠顯著增強機體抵抗外界病毒感染的能力,以此降低機體發病幾率,保持機體的健康狀態[9]。近年來,相關學者陸續報道了一些生物源的免疫調節肽,海參肽[10]、鳙魚肽[11]等都具有優良的免疫調節作用。但目前報道的免疫調節肽多來自于動物與植物,對于高等真菌免疫調節肽的研究較少,在竹蓀屬中尚未見免疫調節肽的報道。

基于以上分析,本文采用磷酸鹽緩沖液直接提取法獲得長裙竹蓀水溶性蛋白,3500 Da透析袋透析,分子排阻色譜法(GE,Superdex 30 Increase)分離,反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化,獲得長裙竹蓀多肽(DIP),通過自由基清除能力評估長裙竹蓀多肽的抗氧化活性,進一步通過評價巨噬細胞RAW264.7的吞噬能力和細胞因子分泌的促進作用來驗證其免疫調節作用,為長裙竹蓀的精深加工應用提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長裙竹蓀子實體 采集自四川省農業科學院食用菌栽培基地,37 ℃烘箱中烘干待用;RAW264.7(小鼠單核巨噬細胞系,ATCC Number:TIP71)細胞 美國ATCC菌種保藏中心;胎牛血清、DMEM培養液 Thermo Scientific公司;青霉素、鏈霉素 美國Sigma公司;一氧化氮、TNF-α、IL-1β、IL-6細胞因子檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;小鼠Toll樣受體檢測試劑盒 上海滬震生物科技有限公司;其余試劑 均為分析純級。

Quest 10中高壓層析系統 Bio-rad;Flexar FX-15高效液相色譜 Perkin Elmer;Microfuge 20R高速離心機 Beckman;Forma 3111 CO2細胞培養箱 Thermo;SpectraMax L酶標儀 Molecular Devices;Delta 1-24 LCS真空冷凍干燥機 Christ;N-1210BS-WB旋轉蒸發儀 Eyela;CKX53倒置顯微鏡 Olympus。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹蓀多肽提取與純化

1.2.1.1 竹蓀多肽復合物提取 稱取長裙竹蓀子實體干品20 g,采用中藥材粉碎機粉碎,過100目篩網,獲得長裙竹蓀子實體干品粉末。按照長裙竹蓀干品/PBS緩沖液(pH6.8)的料液比1∶20 (g/mL)加樣,加樣后磁力攪拌器120 r/min攪拌過夜,取上清,6000 r/min離心10 min后獲得上清液。選擇截留分子量為3500 Da的透析袋透析12 h,流動相選擇超純水,收集透析液,旋轉蒸發儀濃縮,獲得的濃縮液采用真空冷凍干燥機冷凍干燥12 h,可獲得長裙竹蓀多肽提取物干粉。竹蓀多肽提取物得率(%)=(竹蓀多肽提取物干粉質量/竹蓀子實體干品質量)×100。

取長裙竹蓀多肽提取物干粉5 g,無菌水溶解,配制成50 mg/mL的溶液,上樣于Superdex 30 Increase 凝膠過濾柱,無菌水洗脫,部分自動收集器收集洗脫液,215 nm下測定吸光值,收集并凍干單一峰,得到長裙竹蓀子實體多肽復合物。竹蓀多肽復合物得率(%)=(竹蓀多肽復合物干粉質量/竹蓀子實體干品質量)×100。

1.2.1.2 竹蓀多肽(DIP)分離純化 取長裙竹蓀多肽復合物干粉1 g,無菌水溶解,配制成10 mg/mL的溶液,反相高效液相色譜法(RP-HPLC)純化,收集單一峰,獲得純化的長裙竹蓀多肽(DIP)。竹蓀多肽得率(%)=(竹蓀多肽干粉質量/竹蓀子實體干品質量)×100。

色譜條件:PE C18柱(150 mm×4.6 mm),A相:純凈水,B相:含0.1%三氟乙酸的乙腈;流速:1.0 mL/min;進樣量:30 μL;檢測波長:215 nm;柱溫:(25±5) ℃;柱壓:3000 psi;洗脫條件設定為,A相:0～8 min,99%～97%;8～12 min,97%～96%;12～16 min,96%～80%;16～20 min,80%～99%。收集DIP,純水溶解,配制成濃度為5 mg/mL溶液,進行190～600 nm條件下全波段掃描。

1.2.1.3 竹蓀多肽的基本成分測定 進一步完成并比較長裙竹蓀子實體和提取到的多肽DIP的基本組分。水分按照GB/T 5009.3-2010測定;灰分按照GB/T 5009.4-2010測定;蛋白質根據GB/T 5009.5-2010凱氏定氮法測定;多糖含量測定采用苯酚硫酸法。

1.2.2 DIP自由基清除能力測定 依據Oktay等[12]的方法完成DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力測定。取DIP 50 mg,無菌水溶解,配制成5 mg/mL母液,進一步將母液稀釋成濃度為5、2.5、1.25、0.63和0.32 mg/mL的待測液。采用濃度為1 mg/mL的VC作為陽性對照,同一測定重復3次。

1.2.3 DIP對細胞存活率的影響 DMEM培養基培養RAW264.7細胞,取對數期細胞接種于96孔板,細胞密度1×105個/mL,每孔100 μL,5% CO2培養箱37 ℃培養。待細胞貼壁后,將細胞分為8組,每組8個復孔,分別為對照組,100 μL含血清DMEM培養基;7個DIP組,含有DIP的培養基,DIP的最終濃度依次為3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL,空白孔不接種細胞,加入100 μL含血清DMEM培養基,CO2培養箱培養24 h。采用MTT法測定細胞存活率。

1.2.4 中性紅吞噬作用評價 取對數期RAW264.7細胞以濃度2×104個/mL鋪96孔板,每孔100 μL。實驗設定終濃度為10 μg/mL的LPS作為陽性對照,空白組(CK)設定為:100 μL DMEM細胞培養液+100 μL細胞懸液;20 mL DIP+100 μL細胞懸液+80 μL DMEM細胞培養液作為處理組,最終保證DIP的終濃度分別為0、3.13、6.25、12.5、25和50 μg/mL,每組均設立8個復孔。5% CO2、37 ℃條件下培養24 h。之后用PBS洗滌3次,加入中性紅溶液100 μL,使中性紅的終濃度為1 μg/mL,繼續培養30 min。清洗3次后加入裂解液(冰醋酸∶無水乙醇=1∶1)200 μL,靜置過夜,待細胞裂解完全后,在540 nm波長下測定吸光度值。

1.2.5 對細胞信號物質NO分泌的影響 通過Griess試劑法驗證DIP對RAW264.7細胞分泌NO的促進作用。取對數期RAW264.7細胞以濃度2×105個/mL鋪24孔板。實驗處理同上,培養細胞64 h,每隔8 h測定一次NO含量。按照試劑盒說明書進行操作,橫坐標為標準品濃度,對應540 nm下OD值為縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,擬合得出回歸方程,按曲線方程計算各樣品中NO的濃度值。

1.2.6 促細胞因子分泌活性評價 實驗處理同上,細胞培養結束后,取上清液,使用小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的ELISA試劑盒測定其中的TNF-α,IL-1β和IL-6細胞因子的濃度,按照試劑盒說明書操作。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)。以標準品濃度為橫坐標,對應OD值為縱坐標,繪制出標準品擬合線性回歸曲線,得出回歸方程,按曲線方程計算各樣品中細胞因子的濃度值。

1.2.7 Toll樣受體表達的影響 RAW264.7細胞(1×105)接種到24孔板中進行培養,實驗設置同上。培養結束后,消化并收集細胞,采用反復凍融的方法裂解細胞,6000 r/min獲得細胞裂解液,按照試劑盒說明書要求進行膜表面蛋白Toll樣受體TLR4、TLR9的含量檢測。

1.3 數據處理

各組實驗數據以平均值±標準差(X±S)表示,應用統計軟件SPSS 19.0進行分析,多組均數比較采用ANOVA檢驗,P<0.05視為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 DIP分離純化及基本成分測定

2.1.1 DIP提取分離得率 通過3次重復試驗,探索DIP的得率。首先,借助磷酸鹽緩沖液提取,20 g長裙竹蓀子實體粉末得到長裙竹蓀多肽提取物干粉6.42 g,得率為32.10%。5 g長裙竹蓀多肽提取物干粉經過分子排阻色譜得到長裙竹蓀子實體多肽復合物干粉0.51 g,得率為2.55%。0.51 g多肽復合物干粉通過制備型RP-HPLC純化出DIP 0.118 g,得率為0.59%。

圖1 長裙竹蓀多肽分離純化質量Fig.1 Isolation and purification yield of DIP

2.1.2 DIP純化及鑒定 分子排阻色譜結果顯示,透析后的溶液經過Superdex 30 Increase柱凝膠過濾后,依次分離出4個組分(圖2A),分子量由大到小編號為A1-4,通過自由基清除活性初篩,收集A3組分作為長裙竹蓀多肽復合物進行下一步純化。A3上樣RP-HPLC后,共分離出4個組分(圖2B),為B1-4,最終收集B3作為DIP進行下一步實驗。將收集到的B3組分(DIP)配置成濃度為1 mg/mL的溶液進行全波段掃描,獲得DIP掃描圖譜如圖2C所示,DIP在216 nm處出現最大吸收峰,證明DIP是純度較高的多肽。

圖2 長裙竹蓀多肽分離純化Fig.2 Isolation and purification of DIP注:A:分子排阻圖譜;B:RP-HPLC圖譜; C:UV連續掃描圖譜。

2.1.3 DIP基本成分測定 長裙竹蓀子實體中粗蛋白的含量為21.36%，粗多糖含量為28.85%，現有報道認為長裙竹蓀是一種高蛋白、低脂肪，并且具有保健活性的健康食品[1]。通過分子排阻色譜和反相高效液相色譜的分離純化，獲得的DIP中的粗蛋白含量顯著提升，達到了70.35%，是子實體中粗蛋白含量的3倍，確認DIP是一種純度較高的小分子多肽。

2.2 DIP自由基清除活性

DIP對幾種常見的活性氧自由基清除率如圖3所示。DIP對DPPH自由基表現出極強的清除活性,IC50為0.15 mg/mL,與VC相近。DIP對羥自由基具有較好的清除活性,IC50值約為1.18 mg/mL,同樣與陽性對照VC(1.05 mg/mL)相近。DIP對超氧陰離子IC50值約為2.64 mg/mL。

表1 長裙竹蓀子實體和提取多肽(DIP)的基本營養成分Table 1 The nutritional components of the fruiting bodies of Dictyophora indusiata and DIP(g/100 g)

注:*代表同一組分內子實體和DIP的顯著性差異,P<0.05。

圖3 DIP自由基清除活性Fig.3 Free radical scavenging activity of DIP注:A為DPPH自由基;B為羥自由基;C為超氧陰離子自由基;D為IC50。不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖4同。

大量研究證實,人體眾多生理活動都受到氧化壓力的影響。氧化壓力會介導諸如炎癥、衰老、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病及腫瘤等多種疾病[13-14]。許多學者致力于尋找天然抗氧化劑。真菌源抗氧化劑研究較為深入,白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)水提物對H2O2誘導的PC12細胞凋亡具有一定的緩解作用[15],鮑姆木層孔菌(桑黃,Phellinusbaumii)脂溶性提取物具有良好的還原力,可以有效延緩疊氮鈉引起PC12細胞衰老[16]。就具體活性成分而言,真菌多糖、多酚、黃酮類物質是主要抗氧化劑。松茸(Tricholomamatsutake)多糖TMP-A能夠清除DPPH自由基,IC50為2.20 mg/mL[17],印度塊菌(Tuberindicum)多糖TIP-1清除DPPH自由基的IC50值為1.72 mg/mL[18]。DIP對DPPH自由基的清除效果極好,作用濃度為0.32 mg/mL時,清除率接近85%。同樣是抗氧化活性多肽,DIP的DPPH自由基的清除優于牡蠣蛋白酶解多肽(IC50值為1.16 mg/mL)[19]。因此,在研究較為深入的真菌多糖、動物源多肽外,真菌抗氧化活性多肽也可以作為一種天然抗氧化物質,拓寬真菌抗氧化劑的提取范圍。

2.3 DIP的細胞毒性評價

DIP處理RAW264.7細胞24 h,經MTT測試發現,較低濃度DIP(3.13～50 μg/mL)對細胞未見明顯毒性,細胞存活率沒有出現顯著下降(圖4)。然而,繼續提高DIP的濃度,則會表現出一定的細胞毒性。高濃度(100、200 μg/mL)的DIP則會抑制RAW264.7細胞的增殖。基于以上分析,本文選用較低濃度的DIP(3.13、6.25、12.5、25、50 μg/mL)完成后續實驗。

圖4 DIP的細胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of DIP

2.4 DIP的免疫強化作用

2.4.1 中性紅吞噬活性 通過測定RAW264.7細胞對中性紅吞噬能力的改變來驗證DIP能否強化細胞吞噬能力,結果如圖5所示,DIP能夠顯著促進RAW 264.7細胞的中性紅吞噬能力。實驗選擇的最低濃度的DIP(3.13 μg/mL)處理后就能顯著提高RAW264.7細胞的吞噬效果,較空白對照吞噬活性提高了近1倍。當DIP濃度達到12.5 μg/mL,吞噬效果與空白對照呈現出極顯著的差異,已經超過陽性對照LPS。進一步提高DIP濃度,吞噬效果呈現高位穩定。

吞噬作用是巨噬細胞最具有代表性的免疫活動之一。通過中性紅吞噬實驗,我們發現DIP能夠較強的促進細胞的吞噬能力,說明DIP能夠提高先天免疫反應。

圖5 DIP促進RAW264.7細胞吞噬中性紅Fig.5 Enhanced phagocytosis of neutral red of RAW264.7 cells by DIP注:與空白對照組比較,*表示差異顯著P<0.05, **表示差異極顯著P<0.01,圖6、圖7同。

2.4.2 DIP對信息遞質NO分泌的影響 按照Griess試劑法的NO測定試劑盒的要求操作,建立回歸方程如下:Y=0.0322X+0.0968,R2=0.9962(X為所測標準品濃度,Y為所測吸光值),該回歸方程適用的吸光度范圍:0～3.3。

如圖6A所示,DIP處理后,NO濃度極顯著的上升。3.13 μg/mL的DIP使得NO濃度提高了近2.5倍。12.5 μg/mL DIP作用效果與陽性對照LPS相當。進一步提高DIP濃度,NO濃度未出現明顯變化,在高位保持穩定。DIP對RAW 264.7細胞分泌NO的作用十分迅速,32 h可達峰值,隨后急劇下降,陽性對照LPS作用較慢,48 h達到峰值。

NO是最具有代表性的生物活性信息遞質之一,能介導機體免疫、炎癥等多種生理和病理過程。現代研究表明,人體獲得性免疫、自身免疫疾病等都與NO的分泌密切相關[20]。就巨噬細胞而言,一方面,NO可以作為一種細胞毒性成分釋放,直接殺傷侵入有機體的微生物;另一方面,通過多種信號傳導,NO能夠啟動級聯免疫反應,阻止腫瘤細胞繁殖與擴散。實驗中,DIP對NO分泌作用十分迅速,但是有效作用時間較短。DIP作為一種分子量小于3500 Da的多肽,較小的分子量使得其吸收相對迅速。作用時間較短,說明DIP的結構可能不大穩定,因此,如何提高真菌小分子活性多肽的穩定性是今后研究的重點。

圖6 DIP促進RAW264.7細胞產生NO作用(A) 和RAW264.7細胞產生NO時間點(B)Fig.6 NO production(A)and its point in time(B)of stimulated RAW264.7 cells by DIP

2.4.3 DIP對RAW264.7細胞細胞因子分泌的影響 按照ELISA試劑盒的要求,繪制出3種細胞因子的標準曲線,依次建立回歸方程如下:TNF-α：Y=0.0024X+0.1284,R2=0.9923(X為所測標準品濃度,Y為所測吸光值,下同);IL-1β:Y=0.0151X+0.0846,R2=0.9981;IL-6:Y=0.0139X+0.0756,R2=0.9982。

如圖7，DIP對RAW264.7細胞3種細胞因子分泌的促進作用與其濃度直接相關,低濃度作用較弱,中濃度明顯增強,高濃度高位穩定的趨勢。12.5 μg/mL的DIP其促進作用與陽性對照相當,繼續增高DIP濃度,促進作用未見明顯增強。DIP對TNF-α及IL-6分泌促進作用較強。3.13 μg/mL的DIP就能使得TNF-α的分泌呈現出極顯著的差異(P<0.01)。

巨噬細胞通過分泌諸如細胞因子等生物活性物質,以此來調控局部微環境,保護機體免受外界不良因素的侵害[21]。作為一種小分子多肽,DIP對于多肽類的細胞因子分泌的促進作用效果十分明顯,12.5 μg/mL的DIP能夠將TNF-α的含量提高一倍(圖7),已有學者報道400 μg/mL的靈芝孢子粉多糖對腹腔巨噬細胞產生TNF-α的促進率為50%[22],顯然,小分子多肽的促進效率更高,因此,如何分離提純小分子多肽值得進一步研究。

圖7 DIP促進RAW264.7細胞產生細胞因子作用Fig.7 Effects of DIP stimulated cytokines secretion in RAW264.7 cells

2.4.4 DIP對RAW264.7細胞Toll樣受體表達的影響 不同濃度DIP溶液作用于RAW264.7細胞后,細胞膜蛋白Toll樣受體TLR2和TLR4表達量的變化情況如圖8。從圖8中可以看出,DIP處理后,RAW264.7細胞在TLR4和TLR9的表達量顯著升高,均呈現逐漸上升的變化趨勢,表現出一定的劑量依賴關系。DIP作用濃度后,TLR4的表達量峰值為17.09 ng/mL,TLR9的表達量峰值為15.98 ng/mL。

Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原呈遞細胞表面識別多種病原體及內源性物質的跨膜蛋白,能夠高效識別來源于微生物的具有保守結構的分子。巨噬細胞激活后,通過TLRs介導一系列免疫反應,如激活核轉錄因子NF-κB,促進NF-κB的核膜轉位,激活下游的抗凋亡基因(Bcl-2等)、抗腫瘤(TNF-α等)相關蛋白的表達[23]。

通過上述一系列實驗,發現DIP能夠促進Toll樣受體的表達,活化巨噬細胞,增強其吞噬作用并促進其分泌細胞因子,對整個免疫過程都起到一定的強化作用。相關研究證實,激活巨噬細胞是先天和適應性免疫一個關鍵事件,因此,后續實驗應該集中于介導巨噬細胞激活的一系列信號轉導途徑,以探索DIP精細的作用通路。

圖8 DIP對Toll樣受體表達的影響Fig.8 Effect of various concentrations of DIP on Toll like receptor expression

3 結論

本實驗分離獲得長裙竹蓀子實體多肽(DIP)并驗證其抗氧化和免疫調節活性。通過透析,分子排阻色譜和反相高效液相色譜分離可獲得純度較高的多肽DIP,DIP的得率為0.59%,粗蛋白含量70.35%。自由基清除實驗確認DIP具有優良的自由基清除活性,對DPPH自由基表現出極強的清除活性,IC50為0.15 mg/mL。對羥自由基和超氧陰離子自由基也具有良好的清除活性。進一步的功效實驗發現,DIP能夠強化巨噬細胞的吞噬活性,12.5 μg/mL的DIP能夠提高RAW264.7細胞的吞噬活性近200%。DIP能夠促進細胞因子的釋放,12.5 μg/mL的DIP能夠將TNF-α的含量提高1倍。進一步確定DIP可以提高Toll樣受體的活性,通過Toll受體的表達,活化巨噬細胞,在先天和適應性免疫中都能發揮作用。因此,DIP能夠增強機體免疫,可作為一種免疫活性肽加以開發利用,在保健品、藥品開發中具有一定的應用前景。