干燥溫度對醇提余甘子多酚含量及其抗氧化活性的影響

鄧俊琳3,李晚誼,*,于麗娟2,陳 建3,李 宏2,夏 陳3,田 浩2,李智敏

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所,云南昆明 650205; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,云南昆明 650221; 3.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,四川成都 610066)

余甘子為大戟科葉下珠屬植物(PhyllanthusemblicaL.),又名油甘子、牛甘子、魚木果等,是一味重要的傳統(tǒng)民族藥材,其味苦、甘、酸、澀,性涼,主治血熱血淤、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛等癥[1]。衛(wèi)生部于2002年將余甘子列入“既是食品又是藥品的物品名單”之中。作為聯(lián)合國衛(wèi)生組織指定在全世界推廣種植的三種保健植物之一,余甘子廣泛分布于熱帶、亞熱帶,在我國主要分布于海南、福建、廣東、云南等地。余甘子果實含有大量的多酚類、維生素C,黃酮類、多糖等物質(zhì),具有抗氧化、抗癌、抗病毒、降血脂、抗缺氧等作用[2]。其中,多酚類化合物作為植物重要的次生代謝產(chǎn)物,在種子萌發(fā)、植物生長和發(fā)育、抗霜凍和防御病蟲害等過程中均起到重要作用[3-4]。同時多酚類化合物對人類健康也有諸多益處,比如沒食子酸(Gallic acid)、柯里拉京(Corilagin)、鞣花酸(Ellagic acid)均具有抗氧化[5-7]、抑菌作用[5,8-9],訶子鞣酸(Chebulagic acid)具有抗血管生成[10]、改善乙醇誘導的胃損傷功效[11]等作用。

中藥材種類與性質(zhì)各異,干燥方式及干燥溫度通常會影響藥材中的活性成分[12]。目前常用的干燥方式主要有曬干、陰干、熱風干燥、真空冷凍干燥,以及新型的微波、遠紅外、惰性粒子流化床等干燥技術。其中,自然干燥(曬干和陰干)易受天氣變化的影響,干燥不均勻,且長時間大面積接觸自然界的昆蟲[13];熱風干燥較少受到受天氣、氣候等自然因素,便于根據(jù)不同藥效特性控制干燥溫度,其操作簡單,生產(chǎn)成本低,適合工業(yè)化規(guī)模化生產(chǎn),但因物料大面積暴露在氧氣和高溫條件下,其易發(fā)生氧化和熱降解,從而導致產(chǎn)品質(zhì)量下降[14];真空冷凍干燥又稱冷凍干燥,被認為是一種具有高提取率且可以保護多酚類化合物結構不被破壞的有效干燥方式[15],但是真空冷凍干燥設備昂貴、耗能大、投資成本高,在企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中往往受到諸多限制[16];其他新型的干燥技術均存在設備要求高、生產(chǎn)成本高等問題,還未被大規(guī)模的廣泛應用。

目前對余甘子的研究多集中在活性成分、藥理功能等方面,但對其品質(zhì)有較大影響的干燥方式研究甚少,尤其干燥方式對多酚類化合物的影響未見報道。本文擬對干燥方式(熱風干燥:較常用于規(guī)模化生產(chǎn);冷凍真空干燥:被認為是加工高質(zhì)量食品的最佳干燥方法)以及干燥溫度(凍干、40、60、80和100 ℃)進行研究,考察其對余甘子醇提物中沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸和訶子鞣酸4種活性成分的影響,以及對余甘子總多酚含量和抗氧化活性(ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力)的影響,以期為余甘子的合理加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子 2018年3月采收于云南省大理市賓川縣,經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所李晚誼教授鑒定并確認,樣品存檔于四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所功能食品研究室;沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸標準品 色譜純,純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,美國MREDA公司;甲酸、福林酚、AlCl3、沒食子酸、水溶性VE等 均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;0.22 μm微孔濾膜 美國MREDA公司。

FW-100高速萬能粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司;TD-4Z型臺式低速離心機 四川蜀科儀器有限公司;KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;ELX-800型號酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;UV-6100型號紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試樣品溶液的制備 挑選新鮮無損的余甘子果,用刀去核得果肉,分別采用冷凍真空干燥,40、60、80、100 ℃熱風干燥(干燥過程中每隔1 h稱重,當相隔兩次重量之差≤2%時即認定為已烘干),打粉,過60目篩備用。

稱取余甘子果肉粉末1.00 g,加入8 mL 80%甲醇,40 ℃超聲40 min(超聲頻率40 kHz輸入功率200 W),6000 r/min離心10 min,收集上清液,再提取2次,合并3次上清液并定容到25 mL。0.22 μm微孔濾膜過濾,作為高效液相色譜檢測的待測液,其余樣品用于檢測總多酚含量和抗氧化活性。

1.2.2 余甘子果肉醇提物HPLC定量分析 色譜柱:Poroshell 120 PFP柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);DAD檢測器,檢測波長:254、280 nm;柱溫:30 ℃;流速:0.8 mL/min;進樣量5 μL;流動相:1%的甲酸水溶液(A)+乙腈(B)。梯度洗脫:0～5 min,B梯度變化3%～6%;5～10 min,B 6%～8%;10～25 min,B 8%～20%;25～30 min,B 20%～30%;30～35 min,B 30%～70%;35～38 min,B 70%～90%。

標準品溶液的制備:沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸標準品20 mg,分別用甲醇溶解并定容至10 mL作為標準品母液。以二倍稀釋法用甲醇將各標準品母液配制成一系列濃度梯度的標準品溶液,高效液相色譜待測。以沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得線性方程如表1所示。

樣品中多酚單體的含量計算公式如下:

多酚單體含量(mg/g)=待測液中多酚單體濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.2.3 總多酚含量測定方法 采用福林酚法[17]。取10 μL待測液(稀釋適當倍數(shù)),加入20 μL福林酚,混勻,室溫反應5 min,再加入160 μL 5% Na2CO3,混勻,避光反應1 h,于酶標儀上765 nm檢測。以沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:Y=0.0029X+0.0263(R2=0.9982,線性范圍4.30～275 μg/mL)。

表1 沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸標準品的標準曲線(n=6)Table 1 Ctandard curve of gallic acid,corilagin,ellagic acid and chebulagic acid(n=6)

樣品中總多酚含量計算公式如下:

總多酚提取量(mg/g)=待測液濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.2.4 ABTS+自由基清除能力測定 取20 μL待測液(稀釋適當倍數(shù)),再加20 μL超純水(樣品時改為80%甲醇),加160 μL ABTS自由基溶液(K2S2O8溶液和ABTS溶液混合配制ABTS自由基溶液,最終混合液中K2S2O8濃度為2.45 mmol/L,ABTS濃度為7 mmol/L,在室溫下混合液避光孵育16 h,再用pH=7.0的PBS緩沖液稀釋混合液,使混合液734 nm處吸光值為0.7±0.0.2)溶液,避光反應6 min,于酶標儀734 nm處測定吸光值。以水溶性VE的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,制作標準曲線[18]。得回歸方程:Y=-0.006X+0.471(R2=0.997,線性范圍0～47.5 μg/mL)。

ABTS+自由基清除力(mg/g)=待測液濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定 取20 μL待測液(稀釋適當倍數(shù)),加入80 μL超純水(樣品時改為80%甲醇),再加100 μL DPPH(0.2 mmol/L)溶液,混勻,避光反應30 min,于517 nm處測它的吸光值。以水溶性VE的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標,清除率(%)為縱坐標,制作標準曲線[19]。得回歸方程:Y=0.9428X-0.4202(R2=0.997,線性范圍13～104 μg/mL)。

清除率計算公式為:

清除率(%)=(1-Ax/A0)×100

式中:Ax:樣品的吸光度值;A0:乙醇代替樣品時的吸光值。

DPPH自由基清除力(mg/g)=待測液濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復試驗的平均值,應運Microsoft Excel 2007和SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 HPLC測定不同干燥溫度下余甘子果肉中沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸和訶子鞣酸的含量

如圖1所示,沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸在30 min內(nèi)均得到較好分離,樣品溶液色譜圖中4個目標峰,保留時間與標準品溶液的4個色譜峰保留時間一致。

圖1 多酚化合物標準品和余甘子醇提樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard pdyphenol compounds and aloohol extracted samples in the P. emblica注:1:沒食子酸,2:柯里拉京,3:訶子鞣酸,4:鞣花酸;A:80 ℃干燥的余甘子,B:40 ℃干燥的余甘子,C:冷凍干燥的余甘子,D:60 ℃干燥的余甘子,E:100 ℃干燥的余甘子,F:標準品。

由表2可知,隨著干燥溫度的升高,4種化合物含量呈現(xiàn)顯著增加的趨勢,100 ℃烘干的余甘子中4種化合物含量均為最高。推測可能原因有以下四點:其一,高溫造成植物組織細胞破碎促進多酚類物質(zhì)的釋放[19];其二,植物在遭受紫外輻射、高溫、機械傷害等逆境時,苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性會迅速升高,同時積累大量酚酸、類黃酮物質(zhì),以提高植物的抗逆性[20];其三,高溫破壞了原本與多糖、多肽等結合的結合態(tài)酚,使得釋放出更多的游離態(tài)多酚[19];其四,這4種多酚化合物對高溫有較強的耐受,其結構不易被破壞。通常認為物料大面積暴露在氧氣和高溫條件下易發(fā)生氧化和熱降解,從而導致產(chǎn)品質(zhì)量下降,而冷凍干燥在低溫條件下進行,對物料的結構、形狀及營養(yǎng)成分破壞最小[21],因此冷凍干燥也被認為是一種具有高提取率且可以保護多酚類化合物結構不被破壞的有效干燥方式[15]。但在本研究中,與熱風干燥相比較,冷凍干燥樣品中4種多酚化合物提取率均為最低,這可能與高溫促進游離態(tài)酚的釋放,以及這4種化合物的耐熱性有關。

表2 各溫度干燥處理后余甘子醇提物中4種多酚化合物的含量(mg/g)Table 2 Contents of 4 phenolic compounds in the alcohol extract of P. emblica under different drying temperature(mg/g)

注:小寫字母代表不同溫度干燥的余甘子樣品中多酚化合物含量的差異顯著,P<0.05;表3同。

2.2 干燥溫度對余甘子果肉總多酚含量和抗氧化活性的影響

由表3可知,40 ℃時熱風干燥處理下,余甘子中總多酚含量最低(149.89 mg/g);隨溫度升高,總多酚逐漸增加,當溫度達到80 ℃時,總多酚含量最高(200.92 mg/g),100 ℃熱風干燥后余甘子總多酚含量略有下降(但差異不顯著)。冷凍干燥和60 ℃熱風干燥獲得的余甘子總多酚含量無顯著差異。熱風干燥可能一方面促進植物組織細胞破碎和共價鍵的斷裂,促進更多酚類物質(zhì)的釋放[19],另一方面可能導致某些內(nèi)源酶失活,從而阻止酚類物質(zhì)被氧化[22]。但當熱風干燥的溫度過高,可能破壞某些多酚化合物的結構,進而導致總多酚的含量下降。

表4 余甘子醇提物中4種多酚化合物、總多酚和抗氧化活性的相關性分析Table 4 Correlation analysis of 4 phenolic compounds,total polyphenols and antioxidant activity in the alcohol extract of P. emblica

注:*代表顯著相關,P<0.05;**代表極顯著相關,P<0.01。

本次ABTS試驗和DPPH試驗的結果較一致,余甘子抗氧化活性最弱均為40 ℃干燥的樣品,最強為80 ℃干燥的樣品。此外,本實驗中抗氧化活性隨著干燥溫度的變化趨勢與總多酚的變化趨勢也基本一致,這表明醇提液的抗氧化活性與總多酚含量有密切關聯(lián)。多酚是氫或電子供體,具有酚類游離基中間體的共振非定域作用和沒有適合分子氧進攻的位置,不會引起新的游離基或因連鎖反應而被迅速氧化[23],因此具有抗氧化作用。

表3 余甘子醇提物中總多酚含量和抗氧化活性(mg/g)Table 3 Contents of total polyphenols and antioxidant activity in the alcohol extract of P. emblica(mg/g)

2.3 相關性分析

2.3.1 多酚化合物間相關性分析 相關性分析顯示(表4),沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸的含量之間呈現(xiàn)極顯著(P<0.01)正相關。研究表明,沒食子酸經(jīng)莽草酸途徑代謝產(chǎn)生:莽草酸在莽草酸脫氫酶作用下生成3-脫氫莽草酸,3-脫氫莽草酸烯醇化后在3-脫氫莽草酸脫氫酶作用下生成沒食子酸[24]。鞣花酸是沒食子酸的二聚衍生物,沒食子酸經(jīng)脫氫、異構化、聚合、烯醇化等一系列反應后生成鞣花酸[25]。柯里拉京與訶子鞣酸的代謝途徑有待進一步研究。

2.3.2 多酚化合物與抗氧化活性的相關性分析 由表4可知,本研究證實余甘子醇提物總多酚含量與ABTS+自由基清除力極顯著正相關(P<0.01)。研究表明,多酚抗氧化活性的強弱不僅與總多酚的含量有關,還與其種類和組成有關[26]。相關性分析表明,ABTS+自由基清除力與余甘子醇提物中訶子鞣酸呈極顯著正相關(P<0.01),與柯里拉京呈顯著正相關(P<0.05)。本次試驗中,余甘子醇提液的DPPH自由基清除力雖與總多酚含量隨干燥溫度變化趨勢一致,但并未表現(xiàn)出顯著相關性。

3 結論

研究不同干燥方式和不同干燥溫度處理的余甘子中4種多酚化合物和總多酚含量、抗氧化活性,結果表明，與冷凍干燥相比,熱風干燥處理的余甘子樣品其4種多酚化合物含量和總多酚含量更高,抗氧化活性更強。此外,隨著干燥溫度的升高,4種多酚化合物含量逐漸增加,100 ℃時含量均達到最高;余甘子中總多酚含量和抗氧化活性逐漸增強,80 ℃時總多酚含量最高、抗氧化活性最強。綜合來說,80 ℃熱風干燥更利于余甘子中多酚類化合物的釋放,且不會降低其抗氧化活性。

余甘子作為我國的傳統(tǒng)民族藥材,含有豐富的生物活性物質(zhì)以及諸多的生理功效。本文僅對冷凍真空干燥和熱風干燥對余甘子醇提液中的4種多酚化合物含量及醇提液的抗氧化活性進行了研究,對于余甘子加工過程中的指導是遠遠不夠的,其干燥方式和干燥溫度對其它活性成分以及功效的影響還有待進一步研究。