新疆蕪菁果膠多糖組成分析及免疫活性評價

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

新疆蕪菁(BrassicarapaL.),屬于十字花科(Cruciferae)蕓苔屬(Brassica)草本植物,主產于中國新疆天山西南、塔里木西北地區,在新疆南部種植非常廣泛,是具有較長食用歷史的藥食同源植物[1]。《本草綱目》中記載蕪菁“辛、苦、平,無毒,可升可降,能汗能吐,能下能利小便,又能明目解毒,其效甚偉”[2]。藥理學分析表明,蕪菁中含有黃酮、生育酚、多糖、皂苷等多種植物化學物質[3]。

植物多糖是由醛糖或酮糖組成的生物大分子,分為中性多糖和酸性多糖。果膠多糖是一種酸性多糖,可以分為聚半乳糖醛酸(HG)I型、聚鼠李半乳糖醛酸(RG-I)II型、聚鼠李半乳糖醛酸(RG-II)、木聚半乳糖醛酸(XGA)和芹糖聚半乳糖醛酸(AGA)[4],具有免疫調節[5]、抗腫瘤[6]、降膽固醇和血糖[7]等生物活性。新疆蕪菁多糖也越來越受到關注,張謙筱等[8]采用水提醇沉法提取新疆蕪菁粗多糖,并用Savege法除蛋白,活性炭脫色精制多糖;孫蓮等[1]采用水提醇沉法提取新疆蕪菁多糖,衍生化后采用RP-HPLC分離檢測,結果表明新疆蕪菁多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等6種單糖組成,單糖的摩爾比為1.0∶2.5∶5.4∶2.4∶3.4∶3.7;艾克拜爾江·阿巴斯等[9]研究發現新疆蕪菁多糖對小鼠具有顯著的降血糖作用;Wang等[10]研究發現,新疆蕪菁多糖對DPPH自由基、羥基自由基具有明顯的清除能力,清除能力與新疆蕪菁多糖含量具有一定的相關性。然而,目前有關新疆蕪菁果膠多糖組成分析、免疫調節活性的研究尚未見報道。

因此,本文從新疆蕪菁中分離純化得到果膠多糖純品,采用HPGPC、傅立葉紅外光譜、PMP衍生化分析等技術對新疆蕪菁果膠多糖的組成進行分析,同時應用小鼠巨噬細胞RAW264.7模型對其免疫活性進行評價,以期為新疆蕪菁果膠多糖在食品和醫藥領域的應用與開發提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆蕪菁 新疆烏魯木齊市北園春農貿市場;小鼠巨噬細胞RAW264.7 南京中醫藥大學;甲氮甲唑藍(MTT)、單糖標品(鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及巖藻糖,純度>99%)、不同分子量普魯蘭多糖標品(5.9、11.8、22.8、112、212、404及788 kDa) Sigma公司;DMEM培養基、雙抗(青霉素及鏈霉素)、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶消化液 Gibco公司;細胞因子(TNF-α、IL-1β和IFN-γ)ELISA測定試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;乙醚、乙醇、丙酮、三氟乙酸等試劑 均為國產分析純。

101A-1型自動恒溫干燥箱 上海實驗儀器有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;RE-2000A旋轉蒸發器 上海羌強儀器設備有限公司;UV-2450紫外分光光度計 尤尼克有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;BSZ-16OF自動部份收集器 上海精科實業有限公司;VERTEX33傅里葉變換紅外光譜儀 Brucker公司;6890N高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Synergy-2酶標儀 美國Biotek公司;SERIES 3111細胞培養箱 美國Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 新疆蕪菁果膠多糖的提取及分離純化 提取:參照宋思圓等[11]的方法,將干燥的新疆蕪菁粉碎后過60目篩,加入80%的乙醇浸提24 h,重復2次,以去除其中的單糖、低聚糖、色素等雜質,料渣于25 ℃干燥備用。料渣采用液料比75 mL/g、提取溫度93 ℃、提取時間4.3 h及提取次數3次進行熱水浸提,浸提液抽濾取上清,50 ℃旋蒸濃縮至1/8原體積,加入3倍體積無水乙醇后置于4 ℃冰箱過夜,3000 r/min 離心10 min取沉淀,25 ℃干燥,得到即為粗多糖。

純化:參照Wang等[10]的方法,稱取100 mg粗多糖溶解于10 mL蒸餾水,上樣至DEAE-Sepharose Fast Flow(2.6 cm×60 cm)纖維素陰離子交換層析柱中,以0.3 mol/L的NaCl溶液洗脫,流速1.0 mL/min,每管收集10 mL,苯酚-硫酸法[12]測定各管多糖含量,將洗脫液濃縮、透析、凍干得到初步純化的新疆蕪菁果膠多糖樣品;稱取150 mg初步純化樣品,溶于3 mL蒸餾水,上樣至Sephacryl S-200 HR凝膠柱(1.6 cm×100 cm)中,蒸餾水洗脫,流速0.2 mL/min,每管5 mL,苯酚-硫酸法[12]測定各管多糖含量,收集洗脫液,濃縮、透析、凍干,即為新疆蕪菁果膠多糖純品。

1.2.2 新疆蕪菁果膠多糖分子量測定

1.2.2.1 樣品處理 純化后的多糖樣品及不同分子量的普魯蘭標準品用去離子水配成2 mg/mL的溶液,過濾后采用高效液相凝膠透析色譜法(HPGPC)進行檢測。

1.2.2.2 色譜條件 參照Ye等[13]的方法。高效液相色譜連接示差檢測器(RID)及TSK G4000 PWXL色譜柱;流動相:超純水;流速:0.80 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:30 ℃。用5.9、11.8、22.8、112、212、404及788 kDa的普魯蘭多糖標品制備標準曲線,計算得新疆蕪菁果膠多糖的分子量。

1.2.3 新疆蕪菁果膠多糖理化性質分析 參照Dubois等[12]的方法,采用苯酚-硫酸法測定新疆蕪菁果膠多糖的總糖含量;參照Blumenkrantz等[14]的方法,采用間羥聯苯法測定新疆蕪菁果膠多糖的糖醛酸含量;參照Bradford等[15]的方法,采用考馬斯亮藍法測定新疆蕪菁果膠多糖的蛋白含量;參照Kawai等[16]的方法,采用氯化鋇-明膠比色法測定新疆蕪菁果膠多糖的硫酸基含量;參照Li等[17]的方法,采用福林酚比色法測定新疆蕪菁果膠多糖的總酚含量。

1.2.4 新疆蕪菁果膠多糖紅外光譜分析 參照Saleem等[18]的方法,稱取少量的純化多糖樣品(1～5 mg),與適量干燥的KBr粉末(1∶100)混合,研磨均勻后壓片,置于傅立葉紅外光譜儀上在4000～500 cm-1波長范圍內進行紅外掃描,對采集到紅外吸收圖譜進行分析。

1.2.5 新疆蕪菁果膠多糖的單糖組成定量分析

1.2.5.1 樣品水解 參照連紫宛等[19]的方法。稱取5 mg純化多糖樣品于安瓿瓶中,加入2 mol/L的三氟乙酸(TFA)4 mL,將安瓿瓶封口后置于120 ℃下反應2 h,冷卻至室溫,減壓旋干后,加入1 mL甲醇混合,繼續蒸干,重復2～3次。

1.2.5.2 水解樣品的PMP衍生化 參照連紫宛等[19]的方法。將100 μL酸水解溶液與0.6 mol/L的NaOH溶液等體積混合,加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液200 μL,混勻,置于70 ℃的干式恒溫器中反應100 min,冷卻至室溫,再加入0.3 mol/L的HCl溶液100 μL;混合溶液在50 ℃條件下減壓旋干,加入1 mL去離子水重新溶解,另加1 mL氯仿進行萃取,吸取水相,過0.45 μm水系濾膜后HPLC檢測。所有的單糖標品(鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及巖藻糖)和混合單糖標品(將上述所有單糖標品按1∶1混合并配制成不同濃度0.5、1、2、3及4 mg/mL)也按照上述步驟進行衍生化。

1.2.5.3 色譜條件 高效液相色譜連接二級管陣列檢測器(DAD)及RP-C18色譜柱;柱溫:30 ℃;流動相:0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH6.7)和乙腈按83∶17 (v/v)混勻;流速:l.0 mL/min;檢測波長:245 nm。

1.2.6 新疆蕪菁果膠多糖的免疫調節活性研究 將處于對數生長期的小鼠巨噬細胞RAW264.7用胰蛋白酶消化后,配成濃度為(5～10)×105個/mL的細胞懸液,接種于96孔細胞培養板(100 μL/孔),置于CO2培養箱培養使細胞重新貼壁。24 h后,吸棄培養基,加入100 μL不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/mL)的新疆蕪菁果膠多糖溶液,陽性對照組加入10 μg/mL的脂多糖100 μL(LPS),空白組加入100 μL的DMEM培養基,每組設3個平行孔。采用MTT法[20]檢測新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖活性及吞噬能力的影響;采用NO檢測試劑盒和酶聯免疫試劑盒(ELISA)對小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO及不同細胞因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)釋放量進行測定。

1.3 數據處理

所有數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示,繪圖采用Origin 8.5軟件,顯著性分析采用SPSS 20.0統計軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Tukey檢驗。

2 結果與分析

2.1 新疆蕪菁果膠多糖分子量測定

采用HPGPC法對新疆蕪菁果膠多糖分子量進行檢測,結果如圖1所示。

圖1 新疆蕪菁果膠多糖的HPGPC圖譜Fig.1 HPGPC profile of BRP

由圖1可知，新疆蕪菁果膠多糖出現了單一對稱的色譜峰,表明其具有較高的純度;普魯蘭多糖標準品的線性回歸方程為lg Mw=-0.4182t+8.9855,相關系數R2=0.9936,根據新疆蕪菁果膠多糖的出峰時間計算得出其平均分子量為838 kDa。

2.2 新疆蕪菁果膠多糖理化性質分析

通過理化分析,結果表明新疆蕪菁果膠多糖的總糖含量為78.86%±1.01%、糖醛酸的含量為15.82%±1.05%、硫酸基的含量為0.14%±0.05%,但不含有蛋白質和總酚。

2.3 新疆蕪菁果膠多糖的紅外光譜分析

采用傅立葉紅外光譜分析儀對新疆蕪菁果膠多糖進行掃描,主要的吸收峰波數位置如圖2所示。

圖2 新疆蕪菁果膠多糖的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectras of BRP

紅外光譜法是用來研究不同原子之間和極性鍵間的振動,是糖類物質結構研究的一個重要手段。如圖2，新疆蕪菁果膠多糖在3403 cm-1處出現峰型較寬的吸收峰,是由于糖鏈中非游離O-H伸縮振動引起的;2941 cm-1處的吸收峰是由于C-H非對稱伸縮振動引起的;1616 cm-1處的吸收峰是由于結合水的存在與COO-的非對稱伸縮振動共同引起;1413 cm-1處的吸收峰是由于O-H變角振動和C-O的伸縮振動引起的[21];1101 cm-1是由于糖鏈中吡喃環的伸縮振動引起的[22];每種多糖在915～810 cm-1范圍內都有特征吸收峰,而896及833 cm-1處的吸收峰表明新疆蕪菁果膠多糖同時含有α-構型糖苷鍵及β-構型糖苷鍵[23]。由此可初步證明此樣品為多糖結構,特征峰明顯,無其他結構特征峰,應為多糖純品。

2.4 新疆蕪菁果膠多糖的單糖組成定量分析

采用PMP衍生化法對新疆蕪菁果膠多糖的單糖組成進行分析,混合標準單糖PMP衍生色譜圖如圖3所示，果膠多糖PMP衍生化色譜圖如圖4所示。

圖3 混合標準單糖的PMP衍生化色譜圖Fig.3 Chromatogram of PMP derivatives of mixed monosaccharide standards

圖4 新疆蕪菁果膠多糖的PMP衍生化色譜圖Fig.4 Chromatogram of PMP derivatives of BRP

圖5 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞 RAW264.7增殖活性的影響Fig.5 Effect of BRP on proliferation activity of RAW264.7 cell注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),圖5～圖10同。

由圖4可知，根據樣品在色譜圖中出峰時間及峰面積,新疆蕪菁果膠多糖由鼠李糖與半乳糖醛酸兩種單糖組成,且主要為半乳糖醛酸,其對應的摩爾比為1.94∶98.06。該結果不同于Xie等[24]的研究發現,從西藏蕪菁中純化得到的多糖組分都不含有半乳糖醛酸。

2.5 新疆蕪菁果膠多糖的免疫調節活性研究

2.5.1 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖活性的影響 巨噬細胞的增殖活性一般被認為是多糖免疫調節活性的標志[25]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖活性的影響如圖5所示。

采用MTT法檢測細胞增殖活性時,用增殖指數表示樣品對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖活性的影響。當細胞增殖指數大于1時,表示細胞增殖;當細胞增殖指數小于1時,表示細胞生長受到抑制。如圖5所示，與空白組相比,當樣品濃度在12.5～100 μg/mL時,不同濃度的新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖活性,多糖濃度為100 μg/mL時,增殖指數達到1.57,呈現明顯的劑量效應。但當多糖濃度為200 μg/mL時，差異不顯著(與空白組相比，P>0.05)。以上結果表明新疆蕪菁果膠多糖具有免疫調節活性。

2.5.2 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的影響 激活巨噬細胞最顯著的特征是增加其吞噬能力[26],從而起到保護機體和清除異物的功效。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的影響如圖6所示。

圖6 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞 RAW264.7吞噬能力的影響Fig.6 Effect of BRP on phagocytosis of RAW264.7 cell

采用MTT法檢測細胞吞噬能力時,用吞噬指數表示樣品對小鼠巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的影響。當細胞吞噬指數大于1時,表示細胞吞噬能力增強;當細胞吞噬指數小于1時,表示細胞吞噬能力被抑制。如圖6所示，與空白組相比,當樣品濃度在12.5～100 μg/mL時,不同濃度的新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細胞RAW264.7的吞噬能力,多糖濃度為100 μg/mL時,吞噬指數達到1.55,呈現明顯的劑量效應。但當多糖濃度為200 μg/mL時，差異不顯著(與空白組相比，P>0.05)。以上結果表明新疆蕪菁果膠多糖具有免疫調節活性。

2.5.3 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO釋放量影響 NO是具有高活性自由基性質的效應分子,在宿主免疫應答及機體防御中起著非常關鍵的作用[27]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO釋放量影響如圖7所示。

圖7 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞 RAW264.7的NO釋放量影響Fig.7 Effect of BRP on production of NO of RAW264.7 cell

由圖7可知，與空白組相比,當新疆蕪菁果膠多糖濃度在12.5～100 μg/mL時,均可以顯著促進(P<0.05)小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO釋放量,多糖濃度為100 μg/mL時,NO的釋放量達到7.29 μmol/L,呈現明顯的劑量效應,但仍然顯著低于(P<0.05)10 μg/mL的LPS陽性對照組(9.09 μmol/L)。

2.5.4 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的TNF-α釋放量影響 TNF-α主要源自激活的巨噬細胞和T淋巴細胞所釋放的重要細胞因子,具有抵御致病因子及參與免疫應答等生物效應[28]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的TNF-α釋放量影響如圖8所示。

圖8 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞 RAW264.7的TNF-α分泌量影響Fig.8 Effect of BRP on production of TNF-α of RAW264.7 cell

由圖8可知，與空白組相比,當多糖濃度在12.5～200 μg/mL時,新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細胞RAW264.7的TNF-α釋放量,呈現明顯的劑量效應;當其濃度為200 μg/mL時,TNF-α的釋放量達到最大,釋放量為35.15 ng/L,表明新疆蕪菁果膠多糖具有免疫調節活性。

2.5.5 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的IL-1β釋放量影響 IL-1β對激活與調節免疫細胞發揮著重要的作用[29]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的IL-1β釋放量影響如圖9所示。

圖9 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞 RAW264.7的IL-1β分泌量影響Fig.9 Effect of BRP on production of IL-1β of RAW264.7 cell

由圖9可知，與空白組相比,隨著多糖濃度的不斷增大,新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細胞RAW264.7的IL-1β釋放量,呈現明顯的劑量效應;當其濃度為200 μg/mL時,IL-1β的釋放量達到最大,釋放量為3.21 ng/L,但仍然顯著低于(P<0.05)10 μg/mL的LPS陽性對照組。

2.5.6 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的IFN-γ釋放量影響 IFN-γ是具有多種生物學功能的糖蛋白,也是重要的免疫調節細胞因子,可以增強巨噬細胞和T淋巴細胞的活力,起到免疫調節作用[30]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的IFN-γ釋放量影響如圖10所示。

圖10 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細胞 RAW264.7的IFN-γ分泌量影響Fig.10 Effect of BRP on production of IFN-γ of RAW264.7 cell

由圖10可知，與空白組相比,當多糖濃度在12.5～100 μg/mL時,不同濃度的新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著促進(P<0.05)小鼠巨噬細胞RAW264.7的IFN-γ釋放量,呈現明顯的劑量效應;當其濃度為100 μg/mL時,IFN-γ的釋放量達到最大,釋放量為28.25 ng/L,但仍然顯著低于(P<0.05)10 μg/mL的LPS陽性對照組。

3 結論

本論文采用水提醇沉法結合不同凝膠柱色譜分離純化新疆蕪菁果膠多糖,并對其進行組成分析及免疫活性評價。理化分析表明:新疆蕪菁果膠多糖總糖含量為78.86%±1.01%、糖醛酸的含量為15.82%±1.05%、硫酸基的含量為0.14%±0.05%,但不含有蛋白質和總酚;傅立葉紅外光譜、HPGPC及PMP衍生化分析表明:新疆蕪菁果膠多糖為同時含有α-及β-構型糖苷鍵的吡喃糖,分子量為838 kDa,由鼠李糖與半乳糖醛酸兩種單糖組成,其摩爾比為1.94∶98.06;RAW264.7細胞模型結果表明:當新疆蕪菁果膠多糖濃度在12.5～100 μg/mL時,小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖活性、吞噬能力、NO及不同細胞因子的釋放量隨著新疆蕪菁果膠多糖濃度的升高而升高,呈現明顯的劑量效應,說明新疆蕪菁果膠多糖具有很強的免疫調節活性。本文的研究結果為新疆蕪菁果膠多糖類產品的開發和利用提供了一定的科學證據和研究思路。