維生素K2高產菌株的篩選與發酵條件優化

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(1.石河子大學生命科學學院,新疆石河子 832003; 2.新疆阜豐生物科技有限公司,新疆烏魯木齊 830001)

自然界中已發現的維生素K有兩種,即維生素K1(葉綠醌)和維生素K2(甲萘醌),所有維生素K都具有2-甲基-1,4-萘醌母環,區別僅在于3位的側鏈不同(圖1所示)[1]。維生素K2結構是由一個甲基萘醌母環和一條位于母環C3位置上的異戊二烯側鏈組成,根據側鏈上異戊二烯單元個數差異,維生素K2共分為l4種,以MK-n表示,MK-7即側鏈上含有7個異戊二烯單元[2]。維生素K的生理功能一直以來被認為與凝血有關,近年來發現維生素K2可以激活骨鈣素,促使血液中的鈣質沉積到骨骼,對于預防和治療骨質疏松有重要作用;同時,維生素K2可以活化血管中的蛋白質鈣化抑制蛋白基質γ-羧基谷氨酸蛋白,因而會阻礙鈣質沉淀于動脈血管,防止動脈硬化,降低心血管疾病的發病率[3]。

圖1 維生素K1(a)和K2(b)的分子結構Fig.1 Molecular structure of vitamin K1(a)and K2(b)

維生素K2可以由芽孢桿菌、乳酸菌、黃桿菌等多種細菌合成[4],在細菌的氧化磷酸化過程中作為電子傳遞鏈的組分[5-6],國內外研究中,用于合成維生素K2的主要微生物是芽孢桿菌屬微生物和黃桿菌。黃桿菌合成的維生素K2主要以MK-4和MK-6兩種形式存在,芽孢桿菌發酵生成的維生素K2主要是MK-7。在維生素K2的十四個同系物中,MK-7的生理活性好,且半衰期比其他同系物都長,因此所需的服用劑量小,是最佳的維生素K2補充物[3]。2006年,維生素K2(MK-7)已經被FDA和歐洲食品安全管理局批準使用,日本也有維生素K2藥品上市。維生素K2已經成為國際上新興的功能性保健食品。國家衛計委2016年發布公告批準發酵型維生素K2作為食品營養強化劑新品種,并擬將發酵法生產的維生素K2作為營養強化劑加入調制乳粉、固體飲料、風味發酵乳和含乳飲料中。

維生素K2作為新興功能性保健食品,正越來越受到關注。但利用微生物發酵方法生產維生素K2還處于起步階段,最大制約是菌株的產量較低。土壤中芽孢桿菌資源豐富,本研究從土壤中篩選能夠高產維生素K2的菌株,對該菌株進行鑒定,并對其提取方法和菌株的發酵特性進行初步研究,為工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 取自新疆石河子市郊區;維生素K1、K2(MK-7)標準品 日本和光純藥工業株式會社(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.);二氯甲烷、正己烷、異丙醇、甲醇 美國賽默飛世爾公司(Thermo Fisher Scientific Inc.);酵母粉 英國Oxoid公司;大豆蛋白胨 北京奧博星生物技術有限公司;其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司;種子培養基(g/L) 牛肉膏5,蛋白胨10,葡萄糖10,NaCl 5;發酵培養基(g/L) 甘油50,大豆蛋白胨100,酵母粉0.6,K2HPO40.3,CaCl2·2H2O 0.1,MgSO4·7H2O 0.3;菌種傳代保藏培養基(g/L) 蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10,瓊脂粉15。

1200型高效液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器及色譜工作站) 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選方法 將采集的土壤樣品用無菌水稀釋后在95 ℃水浴30 min,然后在種子培養基上劃線分離純化獲得單菌落。挑取單菌落連續劃線分離三次后進行初篩。初篩時將單菌落進行斜面培養后接入發酵培養基中進行搖瓶發酵,發酵結束檢測其MK-7的含量。將含量較高的菌株斜面保存于4 ℃冰箱,再次傳斜面活化后進行復篩。復篩時首先將斜面菌種接入種子培養基培養,種子培養成熟后接入發酵培養基培養,發酵結束檢測其MK-7的含量,保留產量穩定的菌株制備甘油冷凍管(菌液添加20%甘油)保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 培養方法 平板與斜面培養:將篩選獲得的菌種在種子培養基斜面上劃線并放在恒溫箱中37 ℃條件下培養8～12 h。

種子培養:取30 mL種子培養基置于250 mL錐形瓶,將斜面培養后的菌種接種到種子培養基中,放置在搖床中37 ℃下200 r/min培養16～18 h。

發酵培養:取30 mL發酵培養基置于250 mL錐形瓶,按10%的接種量,用移液管將培養好的種子接種到發酵培養基中,放置在搖床中37 ℃下200 r/min培養4 d。

1.2.3 菌種鑒定方法 對篩選獲得的菌株分別采用16S rRNA基因和gyrB基因序列進行分子生物學鑒定。將菌株采用CTAB法提取基因組DNA,以其為模板,設計正向引物和反向引物,進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增,擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后由上海生工生物工程完成測序。將測得的基因序列在GenBank中進行搜索Blast比對,尋找與其同源性最高且已知分類地位的菌種,并采用MEGA6.0軟件以鄰接(Neighbor Joining)法構建系統發育樹[7]。PCR擴增引物采用Prime premier 6軟件設計。擴增16S rRNA基因所用引物為細菌通用引物,引物序列為:27F:AGAG TTTGATCCTGGCTCAG,1492R:GGTTACCTTGTTA CGACTT。擴增gyrB基因所用引物為:F:CCCAA GCTTAACTGCACTGGGAAATYGTHGAYAAYAG,R:CGGAATTCGGATCC ACRTCGGCRTCBGTCATRAT。擴增條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;34個循環;72 ℃延伸10 min。將PCR擴增片段回收后送上海生工生物工程有限公司測序。將測序結果與NCBI數據庫對比,繪制系統發育樹。

1.2.4 發酵樣品中MK-7提取方法 按1.2.2發酵培養方法進行發酵,采用有機溶劑液液萃取方式從發酵液中提取MK-7,選取正己烷與異丙醇(體積比為2∶1)作為萃取液,通過改變水相(發酵液)與有機相(萃取液)的比例,按水相:有機相體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進行提取,確定最佳比例,后續提取均采用最佳比例進行。萃取時將混合物置于渦旋振蕩儀上振蕩5 min,再將混合物3000 r/min離心10 min,吸取上層液體進行濃縮。利用旋轉蒸發儀對有機相進行濃縮5 min,用錫箔紙包裹蒸發瓶進行操作,濃縮后得到黃色油狀液體,加2 mL異丙醇溶解,放于1.5 mL離心管中,用錫箔紙包裹進行避光保存,用于HPLC分析[8]。

1.2.5 樣品中MK-7的分析方法 采用高效液相色譜(HPLC)法對MK-7含量進行測定。色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18;流動相為甲醇∶二氯甲烷(9∶1);流速:1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL;紫外檢測波長:248 nm。將按照上所述提取方法得到的提取液經微孔濾過膜(0.45 nm)過濾后進樣。所有操作避光進行[9]。

標準品的配制:準確稱取10 mg MK7標準品于50 mL棕色容量瓶中,加入30 mL異丙醇充分溶解定容,并在恒溫水浴鍋振蕩1 h。然后按梯度稀釋成濃度分別為1、4、8、16和32 μg/mL的標準液,用0.45 μm微孔濾膜過濾,液相色譜測定,以峰面積和標準品濃度制作標準曲線。

發酵液中的MK-7用1.2.4方法提取后用液相色譜測定,發酵液的MK-7濃度用標準曲線計算獲得。

圖2 基于16S rRNA和gyrB基因的菌株ND系統發育樹Fig.2 16S rRNA and gyrB gene sequence based phylogenetic tree for strain ND

1.2.6 發酵條件優化方法 對高產菌種的碳源、氮源和無機鹽進行單因素優化。發酵培養基中分別添加不同種類的碳源甘油5%、蔗糖5%、葡萄糖5%和可溶性淀粉(5%),根據最終發酵液中MK-7的濃度確定最佳碳源種類,并對最佳碳源的使用濃度進行考察,添加量設為5%、10%、15%、20%進行發酵,確定最佳碳源濃度。

發酵培養基中分別添加8%、10%、12%、14%、16%大豆蛋白胨,根據發酵后MK-7的產量確定最佳氮源。

在添加最優濃度的碳源和氮源條件下,對發酵培養基中的K2HPO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O三種無機鹽的濃度進行優化。K2HPO4的濃度梯度設置為0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 g/L,CaCl2·2H2O的濃度設置為0、0.1、0.2、0.3和0.4 g/L,MgSO4·7H2O的濃度設置為0.1、0.3、0.5和0.7 g/L。

1.3 數據處理

每個實驗重復三次,取三次實驗的平均值,采用Excel(Microsoft office 2010)軟件計算標準誤并作圖。

2 結果與分析

2.1 產維生素K2菌株的篩選與鑒定

由于合成MK-7的主要菌種為芽孢桿菌屬微生物,本研究以芽孢桿菌屬微生物為篩選目標[10-11],經過初篩和復篩,獲得產量較高的5株菌(表1)。后續實驗選定產量最高的菌株ND,并對其進行分子生物學方法進行鑒定。

表1 篩選出的菌株及其MK-7產量Table 1 Selected strains and its MK-7 yield

因為16S rRNA的高度保守性,對相似率極高的近緣種無法做進一步區分,而gyrB基因相對于16S rRNA基因具有較高的堿基替換率,因此比較適合親緣關系較近的菌種的區別和鑒定[12]。本研究采用兩種基因序列比對進行菌種的鑒定。通過PCR擴增分別獲得兩個基因序列,測序后與NCBI數據庫的序列進行Blast比對,并構建系統進化樹。以16S rRNA序列構建的進化樹結果如圖2。從這兩種鑒定方法所獲得的結果來看,本實驗所獲得的菌株ND屬于芽孢桿菌屬的一個分支,且與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株同屬于一個類群。

2.2 樣品中MK-7的定性與定量測定

采用高效液相色譜對發酵液的提取物進行定性和定量。取菌株ND的發酵液,按1.2.4所描述的方法對發酵液進行提取,并利用高效液相色譜檢測提取物中的MK-7,結果見圖3,圖中發酵產物特征峰保留時間在14.1 min,與MK-7標準品的液相色譜圖對比,兩峰保留時間相同,發酵產物特征峰為目標產物MK-7。

圖3 發酵提取物和MK-7標準品的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of fermented extracts and MK-7 standard

按1.2.5的方法對MK-7進行液相色譜測定,以MK-7標準品濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標制作標準曲線,結果見圖4。MK-7與峰面積具有良好的線性關系,其線性回歸方程為y=34.051x+8.7149,R2為0.9994。該線性方程可用來計算樣品中的MK-7濃度。

圖4 MK-7標準曲線Fig.4 Standard calibration curve of MK-7

2.3 萃取液比例對MK-7提取的影響

MK-7是一種脂溶性維生素,所以提取MK-7主要通過使用有機溶劑液-液萃取的方式。常用的有機溶劑為異丙醇與正己烷的混合液[13-14]。為了確定萃取時最佳的萃取液與發酵液的比例,測定了不同比例下萃取效果,結果如圖5所示。在1∶1～1∶2時，隨著有機相體積比例增加,MK-7在有機相中的萃取效果逐漸提高,水相與有機相比例為1∶2時MK-7萃取效果最好,在水相∶有機相=1∶4時萃取效果最差,增大有機溶劑體積并不能提高MK-7的萃取效果。萃取時需要對反應液進行強烈渦旋震蕩,而添加過多的有機溶劑可能不利于震蕩時與發酵液及菌體充分混合和接觸,后續實驗選擇萃取比例為水相與有機相比例為1∶2。

圖5 萃取過程中不同的水相 和有機相比例對MK-7提取的影響Fig.5 Effects of different proportion of water and organic on extraction of MK-7 phase

2.4 MK-7在菌體胞內和胞外的分布

將發酵液離心分離菌體,將菌體和上清液分別進行萃取和測定MK-7含量,確定MK-7在菌體胞內外的分布,結果見圖6。MK-7大部分存在于細胞外,少量存在于細胞內。將發酵液直接萃取獲得的MK-7產量比將菌體和發酵上清液分別萃取略低。上述結果提示大部分MK-7合成后分泌到細胞外。Sato等[15]在枯草芽孢桿菌中發現40%～65%的MK-7分泌到了細胞外,周子民等[16]也在納豆芽孢桿菌中發現有MK-7在發酵過程中有68%的分泌率,本研究的結果與其報道一致。

圖6 菌體胞內和胞外MK-7的含量Fig.6 Concentration of MK-7 in intracellular and extracellular

2.5 發酵條件的優化

2.5.1 碳源對解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 比較了5%添加量的甘油、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉幾種解淀粉芽孢桿菌的常用碳源對MK-7產量的影響,比較結果見圖7。使用甘油作為碳源其效果最為理想。部分文獻報道甘油是合成MK-7的最佳碳源,本論文結果與文獻報道一致[14-16]。根據對解淀粉芽孢桿菌和MK-7的代謝途徑分析推測,甘油分解后產生的3-磷酸甘油醛可以與丙酮酸通過DXP途徑合成MK-7的異戊二烯側鏈部分[17-18],因此推測甘油除了供微生物生長之外,還為MK-7的合成提供前體,促進菌體合成MK-7,故選擇甘油作為最佳碳源。

圖7 不同碳源對菌株ND合成MK-7的影響Fig.7 Effects of different carbon source on the yield of MK-7 production by ND

對甘油的使用濃度進行了考察,從圖8可以看出,當甘油濃度為5%時,MK-7產量最高,因此選擇5%濃度的甘油作為發酵碳源。甘油濃度較高并不利于MK-7合成,可能高濃度甘油對細菌的生長有一定的抑制作用,在其他種類微生物中已有報道[19-20],碳源最終選擇濃度為濃度為5%。

圖8 碳源濃度對菌株ND合成MK-7的影響Fig.8 Effects of carbon source concentration on the yield of MK-7 production by ND

2.5.2 氮源濃度對解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 一些MK-7含量較豐富的發酵食品,例如日本傳統發酵食品納豆[21-22],通常以大豆作為原料進行固態發酵,而在大多數文獻中,大豆蛋白胨是合成 MK-7的最佳氮源[13-16],因此選用大豆蛋白胨作為氮源,研究了不同的大豆蛋白胨濃度對菌體合成MK-7產量的影響,結果見圖9。12%的大豆蛋白胨作為氮源,MK-7產量最高,達到了63 mg/L。大豆蛋白胨中含有豐富的蛋白質、氨基酸、生長因子,作為氮源能促進微生物生長,但氮源濃度過高,導致碳氮比失衡菌體過度生長,其他養分被過早耗盡,菌體衰老而不利于產物的合成[23],因此MK-7產量隨之下降。

圖9 氮源濃度對菌株ND合成MK-7的影響Fig.9 Effects of carbon source concentration on the yield of MK-7 production by ND

2.5.3 無機鹽濃度對解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 在獲得最佳碳源和氮源的基礎上,進一步考察了無機鹽對維生素K2合成的影響，結果見圖10～圖12。結果表明三種無機鹽均對MK-7的合成具有一定的影響,最佳的添加濃度分別是K2HPO4濃度為0.7 g/L,CaCl2·2H2O濃度為0.2 g/L,MgSO4·7H2O濃度為0.5 g/L。適當濃度的鈣離子和鎂離子都對MK-7合成具有一定的促進作用。添加0.2 g/L CaCl2·2H2O,菌株ND合成MK-7的產量達到70 mg/L以上,高于多數被報道過的芽孢桿菌屬微生物[24-25]。磷酸鹽是菌體生長的主要營養成分之一,適量的磷酸鹽在發酵過程中可以促進菌體生長,也能夠直接或間接影響代謝物的合成。金屬離子一般通過影響某些酶的活性而影響產物的合成[23]。有不少文獻報道了金屬離子對微生物發酵的影響,無機鹽一般在低濃度是對微生物生長有促進作用,在高濃度時有抑制作用,不同微生物對無機鹽的需求范圍不同[26-27]。

圖10 K2HPO4濃度對MK-7產量的影響Fig.10 Effects of K2HPO4 concentration on the yield of MK-7

圖11 CaCl2·2H2O濃度對MK-7產量的影響Fig.11 Effects of CaCl2·2H2O concentration on the yield of MK-7

圖12 MgSO4·7H2O濃度對MK-7產量的影響Fig.12 Effects of MgSO4·7H2O concentration on the yield of MK-7

3 結論

本研究通過篩選獲得一株高產MK-7的微生物,將該菌的gyrB基因和16S rRNA與其他微生物的基因進行比對,確定該菌株屬于芽孢桿菌屬,且與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株同屬于一個類群。對該MK-7高產菌株的產物提取進行優化,最優提取溶劑比例為有機相(正己烷∶異丙醇=2∶1):水相(發酵液)=2∶1。將發酵液的菌體和上清液分別進行萃取和測定MK-7含量,確定MK-7大部分分泌到胞外。對培養基中的幾個重要組分(碳源、氮源和無機鹽)及使用濃度進行單因素優化,甘油是MK-7合成的最佳碳源,添加的最適濃度為5%;大豆蛋白胨最適濃度為12%。適當濃度的磷酸鹽和金屬離子Ca2+、Mg2+對MK-7合成有促進作用,添加的最適濃度分別是K2HPO40.7 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L。利用優化后的培養基進行發酵培養,最終該菌株合成MK-7的最高產量達到70 mg/L以上。