乳酸菌和米根霉混合固態發酵對黑青稞生化成分的動態變化

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(1.青海大學農林科學院,青海西寧 810016; 2.青海省青藏高原農產品加工重點實驗室,青海省農林科學院,青海西寧 810016; 3.農業部農產品質量安全風險評估實驗室(西寧),青海西寧 810016)

青稞又稱裸大麥,是青藏高原地區的獨有物種資源,也是藏區人民的主要口糧[1]。黑青稞是一類極其珍貴的青稞種質資源[2-4],具有多種益于人體健康的礦質元素[5],如鋅、銅、鐵等,同時黑青稞具有高蛋白質、高膳食纖維、高維生素、高β-葡聚糖[6]等特點,富含獨特的花青素類物質[7-10],具有較強的消除體內自由基和抗氧化作用[11-13],能夠延緩衰老、預防癌癥[14]。當前,青稞的加工方式主要以糧油制品、發酵青稞酒為研究重點,同時針對β-葡聚糖[15-16]、青稞多肽等功能成分也有大量研究,但針對混菌型青稞發酵技術的研究則非常少。而目前對于黒青稞的研究也主要集中在農藝性狀[17]、營養成分測定[18]、功能成分分離提取[19]等方面,其加工綜合利用研究相對較少,大多集中在黑青稞酒、黑青稞醋、黑青稞米、黑青稞片等產品,對于以固態黑青稞為研究對象對其發酵過程中生化成分變化的研究更是幾乎空白,亟需加強黑青稞發酵產品的研究及開發,提高我國黑青稞資源的利用率。而固態發酵是一種成本較低、利用率較高、污染較少的生產方式,不僅能夠實現黑青稞資源的廣泛利用,還能提高原料的營養及功能性價值,具有廣闊的應用前景。

當前,乳酸菌是公認的、安全的益生菌,其發酵制品深受大眾喜愛,且乳酸菌具有改善腸道微生態環境,增強免疫力和消除機體炎癥等多種生理活性。但由于其自身淀粉酶和蛋白酶相對不發達,難以直接有效利用基質中的營養成分,單獨發酵黑青稞成品品質低、風味差。前期試驗發現,乳酸菌R1和乳酸菌R5發酵性能均較高,且發酵產物品質均較好,但兩株菌區別在于混合發酵后黑青稞制品品質不同,R1混合發酵后制品乙醇含量高,R5混合后制品含酸高、乙醇低,對于不同類型的黑青稞發酵制品,可以選擇不同的菌株進行混合,為黑青稞制品類型的選擇提供依據。因此,本研究選擇固態發酵的傳統菌種—米根霉和乳酸菌混合發酵,探究黑青稞在混菌固態發酵過程中生化成分的變化規律,以達到乳酸菌固態發酵黑青稞的目的。以期為科學判斷黑青稞發酵產品終點和控制發酵過程提供了技術參數,也為進一步開發黑青稞功能性產品提供新的思路和研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌R1、R5由青海省青藏高原農產品加工重點實驗室分離西藏靈菇乳得到,經鑒定均為假腸膜明串珠菌;黑青稞(昆侖17號) 青海省農林科學院作物育種栽培研究所提供;米根霉發酵劑 安琪酵母股份有限公司;葡萄糖標準品(純度≥95.0%) 合肥博美生物科技有限責任公司;其他試劑 均為分析純。

pHS-3C型精密酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司;LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SW-CJ-2型雙人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;N4S 紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;LRH-150型生化培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司;THZ-300C型恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;BCD-649WE型冰箱 青島海爾股份有限公司;DL-5M型高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 MRS培養基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、K2HPO42 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L,調節pH到6.2～6.4,121 ℃下滅菌30 min。

1.2.3 黑青稞發酵工藝流程 黑青稞挑選、去雜→清洗→浸泡→瀝干→蒸煮→冷卻→接菌→發酵→成品

挑選、清洗:選用黑青稞飽滿、去除泥土、沙塵,清洗后用紗布瀝干;浸泡:室溫下浸泡24 h;蒸煮:常壓下蒸煮20 min。

1.2.4 固體發酵

1.2.4.1 乳酸菌單獨發酵 稱取一定量的黑青稞于500 mL燒杯中,向其中加入體積比為1∶2的蒸餾水,并在室溫下浸泡24 h。用紗布瀝干水分后,置于蒸鍋中常壓下蒸煮20 min,并分裝于250 mL三角瓶中,冷卻后按5%(v/w)接種量分別接入乳酸菌R1和R5,置于30 ℃下培養箱中發酵,每隔12 h取樣。

1.2.4.2 米根霉單獨發酵 稱取一定量的黑青稞于500 mL燒杯中,向其中加入體積比為1∶2的蒸餾水,并在室溫下浸泡24 h。用紗布瀝干水分后,置于蒸鍋中常壓下蒸煮20 min,冷卻后按0.5%(w/w)的接種量接入米根霉,置于30 ℃下培養箱中發酵,每隔12 h取樣。

1.2.4.3 乳酸菌與米根霉混合發酵 稱取黑青稞于500 mL燒杯中,加入體積比為1∶2的蒸餾水,在室溫下浸泡24 h。用紗布瀝干水分后,置于蒸鍋中常壓下蒸煮20 min,冷卻后接入0.5%(w/w)的米根霉,并分別接入5%(v/w)的乳酸菌R1和R5,置于30 ℃下培養箱中發酵,每隔12 h取樣。

1.2.5 生化成分的測定 發酵取樣后,分別測定黑青稞在發酵過程中pH、總酸含量、乙醇含量、還原糖含量、氨基酸態氮含量等成分,明確單獨發酵、混合發酵的變化規律。

筆者相信，以村落民俗志為基礎的鄉村研究，在當今中國重述“亞洲”、重寫“世界史”和“全球史”的學術熱潮中，不僅沒有過時，而且不可或缺。畢竟，體察中國國情，理解中國道路，提煉中國話語，仍要以“在村落里研究”[注][美]克利福德·格爾茨：《文化的解釋》，韓莉譯，譯林出版社，1999年，第29頁。 的鄉土中國學術實踐為立足點。

1.2.5.1 pH測定 取10 g發酵樣品,將其搗碎并加入100 mL無CO2的蒸餾水,邊浸泡邊搖動15 min,將其過濾,取濾液采用pHS-3C型精密酸度計直接測定[21]。

1.2.5.2 總酸的測定 采用0.1 mol/L NaOH滴定法測定發酵乳的酸度[22]。

式中:X為樣品總酸含量的質量濃度,%;C為NaOH標準溶液的濃度,mol/L;V為滴定消耗NaOH的體積,mL;V0為樣品稀釋液總體積,mL;VI為滴定時吸取樣液的體積,mL;m為樣品質量,g;K為換算系數,選用乳酸,折算系數為0.09。

1.2.5.3 乙醇含量測定 采用重鉻酸鉀氧化比色法。以乙醇為標準品制作標準曲線[23]。根據標準曲線可得回歸方程:y=0.5566x+0.01138,R2=0.9983。其中y為樣品吸光度A;x為樣品中乙醇含量(mg/mL)。

1.2.5.4 還原糖含量測定 采用3,5-二硝基水楊酸比色法[22]。以葡萄糖為標準品制作標準曲線。根據標準曲線可得回歸方程:y=3.9771x-0.0138,R2=0.9961。式中:y為樣品吸光度A;x為樣品中葡萄糖含量(mg)。

1.2.5.5 氨基酸態氮含量測定 甲醛滴定法[22]。

式中:X1為氨基酸態氮含量,g/100 g;V1為待測液加入甲醛后滴定至pH9.2時NaOH的消耗量,mL;V2為空白樣加入甲醛后滴定至pH9.2時NaOH的消耗量,mL;V3為試樣稀釋液取用量,mL;V4為試樣稀釋液定容體積,mL;m為樣品質量,g;0.014為1 mL NaOH標準溶液(C=1 mol/L)相應的氮的含量,g。

1.2.6 感官評分 采用評分法進行感官評定,以發酵得到的黑青稞產品的外觀(20分)、香氣(30分)、口感(40分)、質地(10分)為評定指標,組織6名(3男3女)經過基礎培訓的人員對黑青稞發酵制品進行評分,取平均值,評分標準見表1。

表1 黑青稞發酵制品感官品質評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of fermented black highland barley

1.3 數據處理

所有實驗均重復3 次。數據用Design-Expert 8.06進行分析。

2 結果與分析

2.1 黑青稞發酵過程中pH的變化

黑青稞發酵過程中的pH與發酵菌株生長繁殖和代謝產物的積累密切相關。由圖1可知,當兩株乳酸菌R1、R5單獨發酵黑青稞時,0～12 h黑青稞pH迅速下降,R1、R5發酵黑青稞的pH分別降低至(4.70±0.01)、(4.37±0.22),之后隨著發酵時間的延長其pH變化趨于穩定;而米根霉單獨發酵黑青稞時,在0～24 h,其pH下降迅速,其后pH穩定在4.41～4.64范圍內。但從圖1可知在整個發酵過程中R5單獨發酵的黑青稞其pH始終低于R1、米根霉單獨發酵的結果,說明R5產酸能力與R1、米根霉相比較強。

將兩株乳酸菌R1、R5分別與米根霉進行混合發酵黑青稞,由圖1可知,隨著發酵時間的延長其pH均呈現下降趨勢。0～12 h時R1+米根霉混合發酵黑青稞其pH迅速下降,之后趨于穩定;而在0～48 h時R5+米根霉混合發酵黑青稞其pH下降迅速,48 h其pH為(4.17±0.06),其后趨于穩定,且在整個發酵過程中,R5+米根霉發酵的黑青稞與菌株單獨發酵及R1+米根霉混合發酵相比,其pH最低,說明R5+米根霉混合發酵產酸能力最強,這可能是由于R5本身產酸能力較高,在混合發酵中其產酸能力占優勢,同時米根霉酶解產生的物質能夠促進R5發酵產酸,使整個發酵更完全。

圖1 黑青稞發酵過程中pH的變化Fig.1 Change in pH of fermented black highland barley during fermentation

2.2 黑青稞發酵過程中總酸含量的變化

黑青稞發酵過程中總酸含量的變化如圖2所示。由圖2可知,隨著發酵時間的延長,黑青稞的總酸含量均呈現逐漸增加趨勢。0～12 h,兩株乳酸菌R1、R5及米根霉單獨發酵黑青稞其總酸含量增加迅速,24 h時總酸含量已達到1.49%±0.13%(R1)、1.98%±0.04%(R5)、1.94%±0.05%(米根霉),其后隨著發酵時間的延長其總酸含量趨于穩定,總酸含量變化規律與pH變化正好相反,同時R5總酸含量高于R1、米根霉,符合上述三株菌pH變化趨勢,R5產酸能力與R1、米根霉相比較強。

由圖2可知,混合發酵黑青稞過程中其總酸含量也均呈現上升趨勢,0～48 h時,R1+米根霉、R5+米根霉混合發酵的黑青稞其總酸含量增加緩慢,48 h后隨著發酵時間的延長其總酸含量迅速升高,兩組混合發酵菌株發酵黑青稞其總酸含量明顯高于三株單獨發酵菌株。另外,R5+米根霉混菌發酵得到的總酸含量最高,60 h時其總酸含量就已達到5.08%±0.04%,這可能是由于米根霉本身具有較高的酶系,能夠將黑青稞的淀粉分解為小分子碳源物質,同時乳酸菌R5本身具有較強的產酸能力,能夠直接利用這些物質,使得整個發酵更為充分,產酸較多。此結果說明添加乳酸菌R5能夠顯著增強其黑青稞發酵過程中總酸含量,能夠改善黑青稞發酵制品風味。

圖2 黑青稞發酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Change in total acidity of fermented black highland barley during fermentation

2.3 黑青稞發酵過程中乙醇含量的變化

黑青稞發酵過程中乙醇含量的變化如圖3所示。由圖3可知,隨著發酵時間的延長,黑青稞發酵過程中乙醇含量均先上升后趨于穩定。菌株單獨發酵時,在0～36 h,R1發酵黑青稞其乙醇含量增加,其后隨著發酵時間的延長其乙醇含量趨于穩定,36～72 h乙醇含量在0.45～0.53 mg/g之間;而R5在0～48 h隨著發酵時間的增加乙醇含量增加,48 h時乙醇含量已達到(2.53±0.22) mg/g,其后乙醇含量趨于穩定;米根霉在0～24 h大量產生乙醇,24 h時已達到(7.85±0.02) mg/g,其后乙醇含量基本達到穩定,其產乙醇含量明顯高于兩株乳酸菌。在菌株單獨發酵黑青稞過程中,米根霉代謝產乙醇含量最高,這可能與米根霉自身的糖化酶有關,能夠高效利用黑青稞中的淀粉,達到高效乙醇發酵。

圖3 黑青稞發酵過程中乙醇含量的變化Fig.3 Change in alcohol content of fermented black highland barley during fermentation

混合發酵時,在0～24 h,兩組混合發酵得到的黑青稞其乙醇含量增加迅速,其后隨著發酵時間的延長其乙醇含量仍處于上升趨勢,但較為緩慢。48 h時,R1+米根霉、R5+米根霉發酵得到的黑青稞制品其乙醇含量分別為(9.23±0.33)、(8.47±0.39) mg/g;60 h后R1+米根霉混合發酵的黑青稞產乙醇含量相較于菌株單獨發酵及R5+米根霉混合發酵最高,達到(9.40±0.41) mg/g;而R5+米根霉混菌發酵的黑青稞其乙醇含量在整個發酵過程中均低于米根霉單獨發酵及R1+米根霉混合發酵。從以上結果可知,米根霉與黑青稞發酵產乙醇密切相關,在米根霉單獨發酵時,其乙醇含量就已達到較高水平,而添加R1進行混合發酵更能促進發酵產乙醇,使黑青稞發酵制品更具風味。但在R5+米根霉混合發酵時,其乙醇含量較低,這可能是由于R5本身具有較高的產酸能力,而產乙醇能力相對較弱,在與米根霉混合發酵時,能夠高效利用小分子碳源物質產生更多的酸,致使乙醇含量相對較低,這對于研制低酒精黑青稞發酵制品更為有利。

2.4 黑青稞發酵過程中還原糖含量的變化

黑青稞發酵過程中還原糖含量的變化如圖4所示。由圖4可以看出,三株菌株單獨發酵時,隨著發酵時間的增加,兩株乳酸菌單獨發酵黑青稞的還原糖含量呈現逐漸降低趨勢,且在0～48 h乳酸菌R5發酵黑青稞的還原糖含量明顯低于R1,但48 h后,兩株菌發酵黑青稞的還原糖含量均趨于穩定，且還原糖含量較為接近,48 h時分別為(0.22±0.01)(R1)、(0.20±0.01) mg/g(R5)。而米根霉單獨發酵黑青稞時,其還原糖含量隨著發酵時間的增加呈現出先增加后略下降趨勢,在48 h達到最大,為(6.94±0.22) mg/g。兩株乳酸菌發酵黑青稞其還原糖含量均下降,可能是由于菌株利用黑青稞中的碳源物質進行增菌和代謝產生乙醇及其他代謝產物,當發酵時間達48 h,其后菌株發酵能力受發酵產物及環境的影響,其還原糖含量趨于穩定。而米根霉發酵黑青稞其還原糖含量先增加后略下降,可能是由于米根霉具有較為發達的酶系,在發酵過程中能夠有效利用黑青稞中的淀粉成分并代謝產生還原糖,但當發酵時間過長,其整個發酵體系不利于米根霉的生長及發酵,還原糖含量略有下降。

圖4 黑青稞發酵過程中還原糖含量的變化Fig.4 Changes in reducing sugar content of fermented black highland barley during fermentation

混合發酵時,隨著發酵時間的增加,黑青稞的還原糖含量均呈現出先增加后略下降趨勢。在0～24 h,R1+米根霉及R5+米根霉混合發酵得到還原糖逐漸增加,24 h時分別達到了(5.00±0.06)、(5.59±0.37) mg/g,36 h后兩種混合發酵得到的還原糖含量較為接近且逐漸趨于穩定;兩種混合發酵與三株菌單獨發酵相比,其還原糖含量明顯高于兩株乳酸菌R1、R5,但卻低于米根霉單獨發酵黑青稞的結果,這可能是因為米根霉本身具備較高的糖化酶,分解產生還原糖含量較多,當混合發酵時米根霉產生的還原糖利于其他菌株的發酵產酸及其他代謝產物,使得混合發酵的還原糖含量低于米根霉單獨發酵的結果,但混合發酵產生的物質更為豐富,且適宜的還原糖含量有利于增加黑青稞發酵制品的甘甜口感,同時能夠延長發酵制品的貯藏時間[24]。而乳酸菌糖化分解能力差,還原糖含量低。因此,與菌株單獨發酵黑青稞相比,混合發酵從口感和營養角度更具優勢。

2.5 黑青稞發酵過程中氨基酸態氮含量的變化

黑青稞發酵過程中氨基酸態氮含量的變化如圖5所示。由圖5可以看出,黑青稞發酵過程中隨著發酵時間的增加,其氨基酸態氮含量均呈現逐漸增加的趨勢。菌株單獨發酵時,三株菌發酵的黑青稞其氨基酸態氮含量明顯升高,0～48 h內R1發酵的黑青稞其氨基酸態氮含量顯著高于R5、米根霉。在48 h時,氨基酸態氮含量分別達到了0.087(R1)、0.059(R5)、0.081 mg/g(米根霉)。混合發酵時,0～24 h,R5+米根霉發酵的黑青稞其氨基酸態氮含量與R1+米根霉混菌組合相比增加迅速,且R5+米根霉發酵得到的氨基酸態氮含量高于R1+米根霉混合發酵的結果;而當發酵時間超過36 h,兩種混合發酵得到的氨基酸態氮含量接近,且在60 h時其氨基酸態氮含量基本一致,其氨基酸態氮含量分別為(0.11±0.002)(R1+米根霉)、(0.11±0.010) mg/g(R5+米根霉)。將三株菌單獨發酵的結果與兩種混合發酵相比,混合發酵得到的氨基酸態氮含量明顯高于菌株單獨發酵的結果。氨基酸態氮含量變化主要是由于微生物利用自身的蛋白酶系降解黑青稞蛋白,一部分小分子的氮源供微生物自身所用,另一部分分解成為游離氨基酸[25],豐富黑青稞發酵制品的風味和口感,提高人體對黑青稞蛋白的利用率[26]。因此,混合發酵黑青稞制品更優于菌株單一發酵的結果。

圖5 黑青稞發酵過程中氨基酸態氮含量的變化Fig.5 Changes in ammonium nitrogen content of fermented black highland barley during fermentation

2.6 混合菌株發酵黑青稞的感官評分

在前期研究過程中發現,R1和R5單獨發酵的黑青稞其乙醇含量及還原糖含量較低,同時其發酵制品表現出明顯的酸味且發酵香味較淡,分別對米根霉單獨發酵、R1+米根霉混菌發酵、R5+米根霉混菌發酵進行感官評定,結果如圖6所示。由圖6可知,不同發酵時間下得到的黑青稞發酵制品其感官性質存在差異。隨著發酵時間的延長,其感官評分呈現先增加后降低趨勢。在發酵初期0～24 h,黑青稞發酵制品呈現質地較硬,無發酵風味及香味;在發酵36～48 h,其感官品質顯著提高,黑青稞發酵制品呈現明顯的發酵香味、香甜可口、軟硬適中,品質較佳;在發酵后期60 h后,感官評分較低,黑青稞發酵制品表現出具有較重的酸味、澀味,質地較為軟爛。綜合比較,混合發酵得到的黑青稞發酵制品及感官品質高于傳統米根霉單一發酵的制品,且R5+米根霉混合發酵48 h時,黑青稞發酵制品品質最佳、口感最優。

圖6 混合菌株發酵黑青稞的感官評分Fig.6 Sensory evaluation of fermented black highland barley fermented by mixed strains during fermentation

3 結論

本研究通過對2株乳酸菌R1、R5與1株米根霉單獨及混合發酵黑青稞進行生化成分動態研究,結果表明,3株菌株單獨發酵過程中,R5發酵的黑青稞其pH明顯下降,最低達到4.32±0.01,且總酸含量顯著高于其余兩株菌,最終達到2.52%±0.12%,說明R5發酵產酸能力較強;而米根霉發酵的黑青稞其還原糖含量及乙醇含量明顯高于R1、R5,最高分別達到(6.94±0.22)、(9.19±0.49) mg/g;R1、R5發酵得到的氨基酸態氮含量較為接近且高于米根霉,最終分別達到(0.10±0.01)、(0.11±0.01) mg/g。與單一菌株發酵黑青稞相比,混菌發酵能顯著提高黑青稞發酵制品的營養品質并改善其風味,其中R5+米根霉混合發酵的黑青稞制品在發酵過程中pH下降較快、產酸較多,pH由5.65±0.08降低至4.16±0.08,總酸含量由0.48%±0.03%增加至7.16%±0.03%,乙醇含量較低,最終僅為(8.25±0.35) mg/g,而氨基酸態氮含量與其他發酵結果接近,另外其感官品質優于其他發酵,48 h評分最高,達到(86±0.89)分,適宜發酵制備低酒精、高營養型黑青稞發酵制品。而R1+米根霉混合發酵的黑青稞制品產酸較少,但其乙醇含量最高,最終達到(9.80±0.60) mg/g,適宜發酵低酸、高酒精黑青稞發酵制品。綜合考慮,最終確定混合固態發酵48 h時其黑青稞制品營養品質及感官特性最佳。根據發酵黑青稞產品的品質及風味要求,可選擇適宜的混合發酵菌株,該結果可為開發黑青稞產品工業化生產奠定基礎。