空氣等離子體技術對面包酵母的誘變選育研究

(石家莊學院化工學院,河北石家莊 050035)

面包酵母即釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是人類掌握并利用的較早的微生物,幾千年前人類就使用面包酵母來制作主食,現代食品工業中也被廣泛使用[1]。好的面包酵母應具備較高的糖酵解效率和麥芽糖發酵利用率、快速的底物適應性和繁殖能力、適宜的水解能力、較強的耐受性等特點[2-4]。目前,由于冷凍面團的開發和利用,對于面包酵母的低溫適應性能等又有了更高的要求。

空氣等離子體是低溫等離子體的一種,屬于活化放電激發形成等離子體,其發生裝置簡單,易于操作[5]。近幾年,有關等離子體技術應用于微生物育種改良的研究已取得了較大的進展。如李小坤等[6]利用常壓室溫等離子體技術進行誘變育種,在處理時間為55 s的情況下,篩選出一株高RNA含量的釀酒酵母,并對其培養條件進行了優化。曹綱等[7]利用等離子體誘變技術處理乳酸克魯維酵母,得到了一株對苯乙酮轉化率高達91.8%的菌株。目前,空氣等離子體技術在面包酵母上的應用未見報道。

本文擬使用空氣等離子體技術對面包酵母進行誘變育種工作,以期得到高發酵力、高抗葡萄糖阻遏能力和高耐低溫能力的,具有良好傳代穩定性的優良菌株,同時為空氣等離子體技術在面包酵母菌種選育中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包酵母BY-1、BY-2、BY-3、BY-4、BY-5 實驗室保藏;面包酵母BY-6 分離自安琪干酵母;麥芽糖標準品(94.3%)、葡萄糖標準品(98%) 中國食品藥品檢定研究院;小麥粉 包頭宏基面粉有限公司;酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司;乙腈(色譜純) 美國Fisher試劑公司。

Agilent 1200series高效液相色譜儀(配備Agilent-380-ELSD蒸發光檢測器) 美國安捷倫公司;電火花發射及檢測器 三魚電氣設備有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備

1.2.1.1 YPD培養基的制備 分別稱取質量分數為1%的酵母膏,2%的蛋白胨,2%的葡萄糖,在121 ℃下滅菌20 min(固體培養基需另加入2%瓊脂)。

1.2.1.2 液體發酵培養基(Liquid Fermentation,LF)的制備 向高純水中分別加入質量分數為1%的葡萄糖、3%的蔗糖、3%的麥芽糖、0.25%的(NH)2SO4、0.50%的尿素、1.6%的KH2PO4、0.50%的Na2HPO4·12H2O、0.06%的MgSO4、0.0225‰的煙酸、0.005‰的泛酸、0.0025‰的VB1、0.00125‰的VB6、0.001‰的VB2、0.0005‰的葉酸,混勻,滅菌后備用[8]。

1.2.1.3 麥芽糖模擬面團培養基的制備 糖類只添加質量分數為3.8%的麥芽糖,其它同1.2.1.2[9]。

1.2.1.4 混合糖模擬面團培養基的制備 糖類只添加質量分數為3.325%的麥芽糖和0.5%的葡萄糖,其它同1.2.1.2[9]。

1.2.2 酵母菌的活化 用接種環挑取酵母斜面保存菌種一環,接入YPD培養基中,于恒溫搖床上30 ℃,150 r/min培養20 h。3000 r/min離心10 min,將菌體使用無菌水清洗2次,接種于固體培養基,備用[10]。

1.2.3 發酵力的測定 本研究采用失重法[11-12]測定菌種的發酵力(F),用量筒量取50 mL LF培養基,加入1.0 g活化后的酵母,將錐形瓶置于30 ℃恒溫搖床上,150 r/min培養3 h,每30 min記錄質量,用重量的變化來表示酵母發酵力大小,見公式(1):

式(1)

式中:F為菌種的發酵力,mg/(h·g);X前為發酵前錐形瓶的重量,mg;X后為發酵后錐形瓶的重量,mg;T為發酵時間,h;m為添加酵母的重量,g。

1.2.4 初始菌種的選擇 取面包酵母BY-1、BY-2、BY-3、BY-4、BY-5、BY-6,采用失重法測定其發酵力的大小,擇優選擇初始菌種。

1.2.5 空氣等離子體對初始菌種的誘變 把等離子體裝置放置于超凈臺中,取滅菌后的5枚小鐵片分別標號為0、1、2、3、4、5置于5個平板中。用移液槍分別移取1.2.4所挑選的初始酵母菌液10 μL于小鐵片上,使小鐵片距電火花發射端約1 cm,開啟設備,分別作用0、5、10、15、20、25 s,將作用后的鐵片放入盛有適量無菌生理鹽水的離心管中,震蕩洗脫菌液,將洗脫后的菌液進行適當稀釋,并進行平板涂布,30 ℃培養20 h,計算致死率。

從每批處理后的菌株中隨機挑取50株菌株進行斜面保藏,同時測定其發酵力,以發酵力高于初始菌株發酵力的5%以上為正突變,計算正突變率。

1.2.6 高發酵力菌種篩選及傳代穩定性的測定 測定篩選得到的正突變菌株發酵力，從而得到高發酵力菌株；選取篩選得到的發酵力較高的面包酵母菌株在菌種斜面培養基上進行傳代,取1、3、6、9、15代的菌株進行發酵力的測定。

1.2.7 蔗糖酶活力的測定 為了保持細胞的通透性及活性,在高糖環境中面包酵母應具備較低的蔗糖酶活力[13-14]。

1.2.7.1 葡萄糖標準曲線的制作 取6支干燥潔凈的試管,分別加入0.01 mol/L的葡萄糖標準液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL,加水至2 mL,混勻后加入DNS顯色液2 mL,然后置入沸水浴中加熱5 min,冷卻后加水至20 mL,以未加入葡萄糖標準液的試管為空白,在540 nm處測定吸光度值并繪制標準曲線。

1.2.7.2 酵母干物質含量的測定 準確稱取1.0 g待測酵母于電熱干燥箱中,95 ℃干燥4 h,然后置于干燥器中冷卻,稱重,并根據公式(2)計算干物質含量。

式(2)

式中:m1為未烘干前的鮮酵母質量,g;m2為烘干后干物質的質量,g。

1.2.7.3 蔗糖酶活力的測定 取潔凈試管加入0.1 mol/L的蔗糖溶液1.0 mL,NaAc-HAc緩沖液(pH=5.2)2.0 mL,水6.5 mL,混勻后于30 ℃水浴中平衡5 min,加入0.5 mL已知濃度的酵母液,迅速混勻后繼續在30 ℃下恒溫5 min,取1 mL反應液于先加入2 mL DNS溶液的試管中,沸水浴5 min,冷卻后測定吸光度值[9],并根據標準曲線求得葡萄糖含量。見公式(3)

式(3)

式中:蔗糖酶活力為在30 ℃,pH為5.2的條件下,每分鐘每g酵母干物質分解蔗糖產生1 mg葡萄糖為一個活力單位,U;A為根據標準曲線方程求得的葡萄糖含量,μmol;0.180為1 μmol葡萄糖的摩爾質量,mg;5為顯色反應時間,min;0.5為加入的酵母液的體積,mL;c為酵母液濃度,g/mL。

1.2.8 葡萄糖阻遏能力的測定 酵母對面團的發酵作用存在葡萄糖阻遏效應[15-16],優良的面包酵母應具備較低的葡萄糖阻遏,這樣才能縮短發酵過程的延滯期,提升酵母的發酵能力。

1.2.8.1 液相色譜檢測條件 色譜柱:Carbohydrate柱(4.6×150 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:乙腈∶水=75∶25;流速:0.7 mL/min;進樣量:3.0 μL;ELSD氣化室溫度:80 ℃;氣體壓力:3.5 bar。

1.2.8.2 待測溶液的處理與測定 稱取1.0 g酵母,在超凈臺中操作分別接入100 mL麥芽糖模擬面團培養基和混合糖模擬面團培養基中,置于30 ℃培養箱中靜置發酵3 h,每隔30 min按照1.2.8.1中的方法進行測定,繪制耗糖曲線[9],并根據公式(4)計算葡萄糖阻遏能力。

式(4)

式中:發酵結束時混合糖發酵液中總糖糖耗為u1;麥芽糖發酵液中糖耗為u2。

1.2.9 菌種耐冷凍性的測定 冷凍面團技術是一種極為方便的食品工業技術,而面包酵母對低溫的耐受性直接決定了冷凍面團的質量[17-19]。對高發酵力的誘變菌株進行耐冷凍性能測定,測定方法如下:

取1.0 g酵母加入50 mL LP培養基中,30 ℃下保溫30 min,測定未冷凍酵母發酵力。取1.0 g酵母加入50 mL LP培養基中,-20 ℃冰箱中冷凍兩周,解凍至30 ℃后測定菌株冷凍發酵力。取新鮮酵母泥于-20 ℃冰箱中冷凍兩周,解凍至30 ℃后,測定酵母泥冷凍發酵力。

相對發酵力(%)=冷凍后發酵力×100/冷凍前發酵力

1.3 數據處理

每組實驗進行3個平行樣,每個平行實驗測定3次取其平均值,結果用“平均值±標準差表示”。數據差異顯著性采用SPSS 18.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 初始菌株的確定

對不同來源的6株菌種進行發酵力測定實驗,并采用失重法測定其發酵力數值,實驗結果見圖1。由實驗結果可知,在6株酵母菌種中,BY-3的發酵力達到(140.906±0.539) mg/(h·g),均高于其它5株酵母菌種,因此選擇BY-3為初始菌株,進行空氣等離子體誘變。

圖1 不同菌株的發酵力測定Fig.1 Fermentation ability of different strains注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2、圖3、圖5、圖7、圖8同。

2.2 空氣等離子體對面包酵母菌株的篩選

2.2.1 作用時間對致死率影響 如圖2所示,在空氣等離子體的作用下,隨著作用時間增加,細胞致死率明顯升高,作用10 s時其致死率達到61.807%±0.881%,作用25 s時,致死率為100%。因此下文正突變率選擇作用時間為5～20 s。

圖2 作用時間和致死率的關系Fig.2 Relationship of treatment time and lethality rate

2.2.2 作用時間與正突變率的關系 結果如圖3所示,正突變菌種多出現在作用10 s時,該點正突變率達到22.000%±0.592%。因此,選擇10 s為最佳的作用時間。

圖3 作用時間和正突變率的關系Fig.3 Relationship of treatment time and positive mutation rate

2.2.3 高發酵力菌株的獲得 以酵母菌BY-3為出發菌株,在10 s下反復誘變[20],得到正突變菌株22株,并測其發酵力，結果如圖4所示,以改良菌株3G-10和3G-28的發酵力提高最為顯著(P<0.05),其中3G-28的發酵力達到209.347 mg/(h·g),較初始菌株BY-3的140.906 mg/(h·g)高出了48.57%。

圖4 正突變菌株發酵力對比Fig.4 Fermentation ability of positive mutation strains

2.2.4 傳代穩定性測定 將BY-3和篩選得到的3G-10和3G-28進行傳代穩定性測試對比,測定結果如圖5所示,在傳代過程中發現,3株菌種的發酵力均出現波動,相比較其它兩株菌種,3G-28的發酵力浮動較平穩,發酵力衰退較慢,傳代15次,其發酵力仍可保持87.5%。可見,菌種3G-28在傳代穩定性方面表現優異。

圖5 不同傳代次數下菌株的發酵力Fig.5 Fermenting power of different strains at different passage number

2.3 蔗糖酶活力的測定

2.3.1 標準曲線的繪制 在540 nm下所測定的葡萄糖標準曲線如圖6所示,標準方程為y=0.1023x+0.0409,R2=0.9992,線性關系良好。

圖6 葡萄糖標準曲線Fig.6 Standard curve of glucose

表1 菌株BY-3和3G-28在混合糖液體培養基中的麥芽糖耗糖結果Table 1 Maltose consumption curve of BY-3 and 3G-28 in liquid medium of mixed sugar

注:同列間不同的字母表示差異顯著(P<0.05);表2～表3同。

表2 BY-3和3G-28菌株在混合糖液體培養基中的葡萄糖糖耗糖結果Table 2 Glucose consumption curve of BY-3 and 3G-28 in liquid medium of mixed sugar

表3 BY-3和3G-28菌株在麥芽糖液體培養基中的耗糖結果Table 3 Consumption curve of BY-3 and 3G-28 in liquid medium of maltose

2.3.2 蔗糖酶活力測定結果 蔗糖酶酶活是影響高糖面團中酵母發酵力的主要因素,對誘變得到的高發酵力菌株3G-28及原始菌株BY-3進行蔗糖酶活力測定,結果如圖7所示,3G-28的蔗糖酶活力為10.944 U/g酵母干物質,較對照株BY-3降低了71.89%。說明與出發菌株相比,經誘變后的菌株3G-28具有更好的耐高糖性能。

圖7 不同菌株的蔗糖酶活力Fig.7 Invertase activity of different strains

2.4 葡萄糖阻遏能力的測定

2.4.1 菌株在混合糖模擬面團液體培養基中的耗糖曲線 菌株BY-3和3G-28在混合糖模擬面團液體培養基中3 h內的耗糖實驗結果如表1、表2所示,菌株3G-28與BY-3對混合糖液中麥芽糖的消耗量存在顯著性差異(P<0.05),而對葡萄糖的消耗沒有顯著性差異,造成該現象的原因可能是葡萄糖總量含量較低,但發酵結束時,菌株3G-28對麥芽糖和葡萄糖的消耗速率均高于菌株BY-3。

2.4.2 菌株在單獨糖模擬面團液體培養基中的耗糖曲線 由表3可知,在發酵1 h內，菌株3G-28與BY-3對于麥芽糖的消耗量存在顯著性差異(P<0.05),當發酵結束時,二者糖耗趨于一致,但3 h總耗糖量較混合糖液培養基明顯增加,其原因可能是存在葡萄糖阻遏現象。

2.4.3 菌株的葡萄糖阻遏現象對比 BY-3和3G-28的葡萄糖阻遏能力對比如圖8所示,篩選菌株3G-28與初始菌株BY-3相比，抗葡萄糖阻遏現象的能力有明顯增加,提高了34.84%。

圖8 BY-3和3G-28菌株的葡萄糖阻遏程度Fig.8 Glucose repression of BY-3 and 3G-28

2.5 菌株耐冷凍性的測定

測定結果如表4所示。從表中可以看出,無論是直接冷凍酵母泥還是冷凍發酵液，3G-28的相對發酵力均高于BY-3。可見3G-28具有較好的耐低溫性能。

表4 BY-3和3G-28菌株的相對發酵力Table 4 Relative fermenting power of BY-3 and 3G-28

3 結論

本文將空氣等離子體技術應用于面包酵母菌種選育工作中,以酵母菌BY-3為初始菌株,經過誘變得到高發酵力菌株3G-28,該菌傳代穩定性良好,其發酵力較初始菌株BY-3提高了48.57%。對該菌株的性能進行測定,發現經過空氣等離子體誘變后,3G-28菌株在高糖面團和無糖面團中均能保持較高的酵母活力,其蔗糖酶活力較初始菌株BY-3降低了71.89%;抗葡萄糖阻遏現象的能力提高了34.84%。除此之外,3G-28菌株在低溫耐受性方面優于初始菌株BY-3:在-20 ℃低溫下進行保藏,兩周后,其菌株的相對發酵力可達到76.10%,酵母泥的相對發酵力為83.91%。本實驗為面包酵母的菌種選育提供了一定依據,但突變株3G-28性能提高的機理尚不清楚,有待研究。