廣譜抑菌性多粘類芽孢桿菌的篩選及其細菌素理化特性

(南京師范大學食品科學與工程系,江蘇南京 210097)

隨著生活水平的提高,人們對食品品質和食品安全越來越重視。食品添加劑的安全性越來越受人們關注,因此占主導地位但有一定危害的化學防腐劑的使用量逐漸減少,而天然防腐劑成為近年來的熱點,其中生物保鮮是常用的化學防腐劑的替代方法。生物防腐劑的有效發展可作為化學防腐劑的替代途徑,生物防腐劑通過微生物的新陳代謝產生抑菌物質起到防腐保鮮的作用[1]。細菌素已被用于治療傳染病、預防胃腸道疾病、維持人體健康以及作為食品工業中的防腐劑[2]。目前乳酸菌細菌素研究的較多,但在商業中成熟應用較少[3-4]。相比而言,學者對產生抑菌物質的多粘類芽孢桿菌關注相對較少,因為多粘類芽孢桿菌屬細菌能夠產生多種不同化學結構的抗菌多肽,所以對產細菌素的多粘類芽孢桿菌的研究顯得更有意義[5]。廣譜抑菌性多粘類芽孢桿菌具有廣泛的抑菌性,抑菌成分多為多糖、多肽、蛋白質等。抑菌機理多為作用于目的菌的細胞壁、細胞膜等,從而達到抑菌的效果。

國內外學者從不同的環境中分離篩選出產細菌素的芽孢桿菌。如Kavitha等[6]在水稻的根際土壤中篩選出一株優良多粘類芽孢桿菌VLB16,對稻紋枯病菌的生長具有良好的抑制作用。Balaiah等[7]從發酵番茄果實中分離到一株芽孢桿菌NP75,對革蘭氏陽性細菌有顯著的抑菌活性。Yang等[8]篩選出一株多粘類芽孢桿菌Jsa-9,其產生的細菌素對食品中的優勢腐敗菌有良好的抑制作用。Kim等[9]從韓國東大麥根際分離出一株多粘類芽孢桿菌E681,具有促進植物生長和抑制植物病害的能力。目前國內外研究的多粘類芽孢桿菌抑菌普較窄,且多應用于生物防治,在食品防腐中應用極少。為獲得新穎、抑菌活性更為穩定的細菌素,本文擬從不同環境中的湖泥、土壤中分離篩選具有廣譜抑菌作用的多粘類芽孢桿菌菌株,進而為生物保鮮新品種的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湖泥和根系土壤 取自玄武湖、中山陵景區、南京清涼山、南京國防園、南京師范大學隨園校區;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)、大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 均由南京師范大學實驗室保藏;LB肉湯、LB瓊脂培養基、營養瓊脂培養基 BR,南京騰春生物試劑有限公司;胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、氯化鈉、革蘭氏染色試劑盒、蔗糖 AR,南京騰春生物試劑有限公司;DNA抽提試劑盒、通用引物 上海生工生物工程技術服務有限公司。

CJ-2S型超凈工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司;生化培養箱LRH-250A 廣東省醫療器械廠;自動高壓滅菌鍋HVE-50 南京博惠科學儀器有限公司;ALLEGRA64R臺式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter 公司;電子分析天平AUY220 日本ShiMADzu;Phs-3C精密pH計 上海三信儀表廠;DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;TH2-C恒溫搖床 太倉市實驗設備廠;2720 thermal cycle PCR儀 上海巴玖實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離純化 取1 g分離樣品于9 mL無菌生理鹽水中,混勻后于80 ℃水浴30 min,殺死營養細胞,10-1～10-7梯度稀釋,取梯度稀釋液100 μL涂布于LB固體培養基,觀察細菌菌落的形態特征,對疑似菌落進行革蘭氏染色[10],挑取產芽孢的革蘭氏陽性單菌落于LB固體培養基中培養36 h后,保存于4 ℃冰箱備用。

將已分離的菌株置于LB肉湯液體培養基中180 r/min、37 ℃搖床培養24 h,發酵液經過10000 r/min離心15 min,棄沉淀,0.22 μm的濾膜過濾上清去除菌體,獲得拮抗液。利用平板打孔法測定抑菌活性,取大腸桿菌培養液(1.0×108CFU·mL-1)均勻涂布于固體培養基表面,于每個孔中加入100 μL拮抗液,培養24 h,觀察抑菌作用,記錄抑菌圈直徑[11-12]。

1.2.2 H2O2作用的排除 H2O2作用的排除參照張艾青等[13]方法,利用H2O2受熱分解的特性,取菌株發酵產物于80 ℃水浴加熱10 min,參照1.2.1測定除去H2O2的上清液對大腸桿菌的抑菌直徑。

1.2.3 蛋白酶的處理 取排除H2O2作用的拮抗液,分別加入蛋白酶k、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶,使酶的終濃度為2 mg/mL,在酶的最適pH下,37 ℃保溫2 h,再將pH調回至6.8±0.2,以不加酶液的拮抗液作為對照,參照1.2.1測定蛋白酶和非蛋白酶處理后上清液對大腸桿菌的抑菌直徑。

1.2.4 菌株鑒定 根據目標菌的形態特征結合革蘭氏染色,并依照《微生物學實驗教程》[14]提供的途徑進行生理生化實驗,參照《伯杰細菌鑒定手冊》[15]做出初步鑒定。之后進行16S rRNA序列同源性分析鑒定[16],把得到的測序結果利用NCBI的Gen Bank數據庫進行BLAST分析,按照序列同源性選擇不同模式菌株,利用MEGA6.06軟件構建系統發育樹,從而確定菌株XW4的種屬。

1.2.5 溫度和pH對細菌素的影響

1.2.5.1 溫度對細菌素的影響 菌體培養物以2%的接種量接入50 mL LB培養基中,37 ℃培養24 h,取上清液分別于60、80、100、120 ℃水浴中處理30 min,冷卻至室溫后,參照1.2.1測定上清液對指示菌大腸桿菌的抑菌直徑[17]。

1.2.5.2 pH對細菌素的影響 菌體培養物以2%的接種量接入50 mL LB培養基中,37 ℃培養24 h,獲得拮抗液,用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調節無細胞發酵上清液pH,使其pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,37 ℃保溫2 h后,再調回至初始pH6.8±0.2,參照1.2.1測定上清液對大腸桿菌的抑菌直徑[17]。

相對抑菌率(%)=[(對照組擴展直徑-處理組擴展直徑)/對照組擴展直徑]×100

1.2.6 細菌素抑菌譜 以主要的食源性致病菌大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和克氏原鰲蝦優勢腐敗菌賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus)做為指示菌,活化后稀釋到1.0×108CFU·mL-1,涂布接種于營養瓊脂培養基表面,參照1.2.1測定上清液對各指示菌的抑菌直徑[17]。

1.3 數據處理

實驗中每組數據均進行3次重復,數據用Excel 2007軟件處理。

2 結果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌菌株的篩選

利用高溫水浴殺死營養細胞體的方法,從樣品中共分離出103株產芽孢細菌,通過革蘭氏染色和芽孢染色后,發現其中87株菌同時具有革蘭氏陽性、產芽孢、桿狀細胞的特點,初步確定這87株菌屬于芽孢桿菌屬細菌。

2.2 抑菌物質產生菌株的篩選

利用瓊脂擴散法,以大腸桿菌為指示菌,對從湖泥中分離的87株芽孢桿菌屬細菌進行抑菌活性檢測,選取一株抑菌效果最好的菌株將其命名為XW4,結果如圖1所示。由圖1可見,XW4對大腸桿菌有抑制作用,能形成抑菌圈,圖1中該細菌素抑菌圈平均直徑為(17.86±0.33) mm,打孔直徑為6 mm;選用XW4菌株作為進一步試驗的測試菌。

圖1 菌株對指示菌的抑菌作用Fig.1 The antimicrobial effect of the selected strain

2.3 排除H2O2的抑菌作用

細菌生長代謝過程所產有機酸、H2O2以及菌體細胞常常也具有抑菌作用,初步篩選的XW4需進一步確定其抑菌活性是否為細菌素所致。由于拮抗液的制作過程包含過濾除菌環節,故排除菌體細胞的影響;此外,在發酵前后上清液的pH無顯著變化為6.8±0.2,排除酸的干擾;加熱法分解H2O2,結果如圖2所示。由圖可知上清液排除H2O2后仍然具有顯著抑菌作用,抑菌圈直徑平均為(16.88±0.71) mm,和處理前相比抑菌性變化不大,初步判斷H2O2不是XW4的抑菌物質。

圖2 H2O2 排除后的抑菌作用Fig.2 The antimicrobial effect of Bacillus XW4 after eliminating H2O2

2.4 對蛋白酶的敏感性

為確定XW4的抑菌物質是否為蛋白或肽類,分別用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶k、胃蛋白酶對上清液進行處理,抑菌結果見圖3。圖3表明,拮抗液中加入不同蛋白酶后,加蛋白酶k與對照相比抑菌圈直徑顯著減小,抑菌活性降低;而木瓜蛋白酶和胰蛋白酶、胃蛋白酶對上清液抑菌活性的影響較小,抑菌圈相對抑菌率為6.82%、5.89%、11.00%,與對照組相比差異不顯著;蛋白酶k對其抑菌活性的影響較大,其相對抑菌率為50.5%。從酶處理的結果來看,說明XW4所產抑菌物質為蛋白類的細菌素物質。由于細菌素的氨基酸組成特征不同,造成細菌素對蛋白酶的敏感型不同。

圖3 蛋白水解酶對芽孢桿菌XW4細菌素活性的影響Fig.3 The effect of proteolytic enzyme on the activitiy of bacteriocin from Bacillus XW4注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 菌株鑒定

2.5.1 菌株XW4菌體形態學觀察 由圖4可觀察到菌落成圓形,直徑大小0.9～1.7 mm,白色菌落,半透明,表面光滑濕潤,革蘭氏染色呈陽性,放大倍數為100時顯微鏡觀察下細胞形狀為長桿狀。

圖4 菌株XW4的形態特征Fig.4 The morphological characteristic of train XW4

2.5.2 生理生化特征 菌株XW4的生理生化測定結果見表1。由表1可知,菌株XW4能還原硝酸鹽、水解淀粉等。根據鑒定結果查表,并結合革蘭氏染色觀察結果,可初步確定XW4菌株屬于多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。

表1 芽孢桿菌XW4的生理生化特征 Table 1 Biochemical characteristic of Bacillus XW4

注:“+”表示為陽性;“-”表示為陰性。

2.5.3 細菌16S rDNA基因序列分析和系統發育樹構建 測試菌株XW4經過擴增電泳后得到大約1498 bp的序列。將測序的結果輸入到Genebank中,使用Blast功能對目的序列與Genebank庫中的已有數據序列進行同源性比對[18]。Clustal X 1.8對齊之后使用MEGA 5.0計算序列相似性,構建系統發育樹,發育樹結果見圖5。軟件進行序列分析后,菌株XW4與同源性搜索后關系最近的前2株來自多粘類芽孢桿菌的親緣性最高,與菌株PaenibacilluspolymyxaKRO58350.1處于同一個小分支,親緣關系最接近。結合菌落形態學特征和生理生化鑒定的結果,菌株XW4被鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。

圖5 菌株XW4的16S rDNA序列系統發育樹Fig.5 The developmental phylogenetic tree of XW4 based on 16S rDNA

2.6 溫度和pH對細菌素的影響

2.6.1 溫度對細菌素的影響 經過不同溫度處理后結果如圖6所示。由圖6可知,菌株XW4的拮抗液經60、80和100 ℃處理30 min后,對大腸桿菌的抑菌活性基本無影響,抑菌圈直徑保持在(16±0.30) mm范圍內;經120 ℃處理30 min后仍具有一定的抑菌性,表明XW4所產細菌素有顯著的熱穩定性。研究發現地衣芽孢桿菌產生的桿菌素490是一種新型的食品抗菌劑,在熱處理和貯藏過程中表現出良好的穩定性,在高溫下也具有殺菌活性[19]。蘇云金芽孢桿菌HD868所產細菌素在90 ℃時相對耐熱,但煮沸30 min后未檢測到菌素活性[20]。地衣芽孢桿菌MKU3所產細菌素在100 ℃ 維持10 min時穩定,在121 ℃時15 min失去活性[21]。蘇云金桿菌SF361產生的細菌素，其活性在50 ℃維持30 min時穩定,在80 ℃以上時，維持10 min，其活性降低到無法檢測到的水平[22]。解淀粉芽孢桿菌J4產生的細菌素在80 ℃、20 min穩定,在100 ℃、15 min失活[23]。枯草芽孢桿菌sly-3產生的細菌素在100 ℃的溫度下保存60 min不會失去任何活性[24]。綜上所述與已報道的菌株相比XW4產生的抑菌物質熱穩定性突出,有良好的應用前景。

圖6 溫度處理對多粘類芽孢桿菌XW4抑菌效果的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of bacteriocin from Paenibacillus polymyxa XW4

2.6.2 pH對細菌素的影響 不同pH條件下菌株XW4的拮抗液對大腸桿菌的抑菌活性變化情況如圖7所示,由圖7可知,XW4所產細菌素在相對較寬的pH范圍(pH3.0～11.0)內抑菌活性穩定,pH9.0～11.0的堿性環境中抑菌活性相對其他報道耐受性較強。處于pH7.0的中性條件下抑菌活性最強,低于或高于此值的偏酸或偏堿環境時,抑菌活性會不同程度遞減。pH3.0的偏酸環境時,抑菌活力減少到77.04%,pH11.0的偏堿環境中,抑菌活力減少到79.75%。偏堿環境下的抑菌效果強于偏酸環境下的抑菌效果。而相關研究多有報道偏堿環境下的抑菌效果弱于偏酸環境下的抑菌效果。蘇云金芽孢桿菌菌株BUPM103中提取的一種新的細菌素F103在pH3.0～10.0范圍內活性均穩定[25]。克勞氏芽孢桿菌GM17產生的細菌素在pH3.0～9.0范圍內活性均穩定[26]。枯草芽孢桿菌H27產生的細菌素在pH3.0～9.0范圍內活性均穩定,在pH10及以上時無活性[27]。多粘類芽孢桿菌JB05-01-1產生的抗菌物質,活性在2～9的pH范圍內均穩定[28]。因此，該細菌素的這一特性不但有利于其在弱酸性、中性,而且在堿性食品中都可作為防腐劑的使用。

圖7 pH對多粘類芽孢桿菌XW4抑菌效果的影響Fig.7 Effect of pH on the activitiy of bacteriocin from Paenibacillus polymyxa XW4

2.7 細菌素抑菌譜

通過平板打孔法檢測菌株XW4抑菌普,結果見圖8。結果表明,該拮抗液抑菌譜較廣,分別對G-菌(如大腸桿菌)和G+菌(如金黃色葡萄球菌)均有良好抑菌作用,抑菌圈的直徑均為(17±0.86) mm;對克氏原鰲蝦優勢腐敗菌賴氨酸芽孢桿菌有顯著的抑制作用,抑菌圈直徑為(18±0.47) mm;對食品中常見腐敗菌枯草芽孢桿菌抑菌效果良好,抑菌圈直徑為(17±0.37) mm。表明菌株XW4所產細菌素具有廣譜抑菌性,對克氏原鰲蝦優勢腐敗菌賴氨酸芽孢桿菌有顯著的抑制作用。多粘類芽孢桿菌XW4所產細菌素對食品中的常見優勢腐敗菌有顯著抑制的作用,表明其在生物保鮮方面的應用有良好的前景。

圖8 多粘類芽孢桿菌XW4所產細菌素的抑菌譜 Fig.8 Inhibition spectrum of bacteriocin produced by Paenibacillus polymyxa XW4

3 結論

本研究從湖泥中分離得到1株不僅對食物中的腐敗菌及致病菌具有顯著抑菌作用，而且對水產中克氏原鰲蝦優勢腐敗菌具有良好抑菌作用的芽孢桿菌菌株XW4,經生理生化試驗和16S rDNA鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。抑菌物質具有顯著的熱穩定性,100 ℃ 處理30 min后活性仍為原來的79.63%,120 ℃ 處理30 min后抑菌活性為原來的31.82%。抑菌活性在pH3.0～11.0范圍內穩定,XW4的抑菌物質在堿性環境中穩定性與已報道的相比更好,在堿性環境中活性減弱幅度較小且抑菌效果顯著,利用這一特性可作為堿性食品保鮮劑。經蛋白酶k處理后抑菌活性顯著降低,初步可以推測抑菌活性物質為蛋白質類的細菌素。該抑菌物質抑菌譜較廣,包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌,且抑菌效果顯著。因此，本實驗室從克氏原鰲蝦分離出的優勢腐敗菌，其細菌素有顯著的抑菌效果,為生物保鮮行業的廣泛應用奠定了基礎。本研究將會進一步分析菌株XW4的抑菌物質結構、安全性和抑菌機理,為其商業化應用奠定基礎。