川白獺兔兔肉肌原纖維蛋白熱誘導凝膠制備工藝優化

陳煉紅,王琳琳,簡文素2,汪 平2,張 巖

(1.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041; 2.四川省草原科學研究院,四川新津 611430)

川白獺兔是以德系獺兔與美系獺兔為育種素材,經過近13年選育而成的具有生長速度快、體型大、被毛密度好、槍毛比例低等生產性能突出的獺兔新品種,也是我國第一個自主培育的獺兔新品種,目前已在我國多省市累計推廣11.30萬只,改良獺兔27萬只,經濟社會效益較好,深受養殖戶和社會的廣泛認可[1]。川白獺兔肉具有肌纖維細嫩,易于消化吸收,蛋白質含量高、脂肪含量低等優點[2]。隨著消費市場對獺兔皮毛需求量的日益增大,獺兔的養殖規模也在逐漸擴大。但是,現階段對獺兔的研究和利用主要集中在其皮毛上,而關于獺兔肉加工利用的相關研究報道不足[3]。因此,對川白獺兔肉加工特性進行研究,有利于提高獺兔肉的綜合加工與利用。

肌肉肌原纖維蛋白在肉品蛋白質凝膠過程中起著極其重要的作用,且其形成凝膠的能力均高于其他動植物蛋白質[4]。在肉制品生產加工過程中,肌原纖維蛋白的熱誘導凝膠特性是最重要的功能特性之一,對于提高肉制品的加工性能具有重要意義[5-6]。在肌原纖維蛋白凝膠特性相關報道中,研究主要集中在通過改變外源非肉蛋白種類、肌原纖維蛋白濃度、離子強度、pH、肌肉種類、外源物質、加熱方式等,探索上述因素對凝膠產品的質構、持水性、乳化性及流變學等特性的影響,從而達到改變肉制品功能特性的目的[7-10]。崔旭海等[11]研究發現添加不同種類的分離蛋白對鯉魚魚糜凝膠特性影響較大。Bertram等[12]和Chantrapornchai等[13]研究均指出離子強度的增加有利于提高蛋白凝膠的持水性。同時,熱誘導溫度也對肌肉蛋白的凝膠特性具有重要影響,過高或者過低的熱處理溫度均不利于凝膠的形成[14]。目前,有關肌肉蛋白熱誘導凝膠特性的研究主要集中在豬肉[5-6]、羊肉[7]、雞肉[10]、魚肉[11]、白兔肉[13]和鴨肉[14]等原料肉,而在獺兔肉肌肉蛋白凝膠特性方面還尚未見報道。因此,有必要對獺兔肉肌原纖維蛋白的凝膠特性進行研究與探討。

本研究以獺兔肉背最長肌為試驗材料,探究大豆分離蛋白添加量、肌原纖維蛋白濃度、離子強度和pH等因素對獺兔肉肌原纖維蛋白凝膠質構特性和持水性的影響;通過單因素和響應面試驗,確定獺兔肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響因素及最佳誘導條件,以期為獺兔肉的加工利用提供理論支持和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隨機選取相同飼養環境條件下的150日齡白色獺兔 采自四川草科院獺兔所自主培育的白色獺兔品系共20只(公母各半),宰后立即取背最長肌作為試驗材料,將所有肉樣用自封袋包裝并冷藏帶回實驗室,置于-18 ℃條件下凍藏待測;磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、氯化鎂、二硫蘇糖醇(DTT)、疊氮化鈉、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、磷酸、乙醇、氫氧化鈉 均為分析純,購自成都市科龍化工試劑廠。

PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;TD4A臺式離心機 長沙英豪儀器有限公司;UV-2102C/PC/PCS紫外-可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;TA-XT plus質構儀 英國Stable Micro System公司;Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;FSH-2A可調高速組織勻漿機 金壇市華城海龍實驗儀器廠;MP511 Lab pH計 上海三信儀表廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白提取 參照Xiong等[15]的方法并作改進。將肉樣進行空氣解凍,去除結締組織和脂肪組織并制成肉糜,取28.5 g肉樣,加入250 mL分離緩沖液A(50 mmol/L K2HPO4,100 mmol/L KH2PO4,0.1 mol/L KCl,2 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L DTT,1 mmol/L 乙二醇二乙醚二胺四乙酸,pH7.0),勻漿2 min,并在4 ℃、5500 r/min條件下離心10 min,取沉淀,重復以上離心步驟3次后所得沉淀即為粗肌原纖維蛋白。進一步純化,加入100 mL分離緩沖液B(1 mmol/L NaN3,0.1 mol/L NaCl,pH6.25),充分溶解后,在4 ℃、5500 r/min條件下離心10 min,取沉淀,重復以上離心步驟3次后所得沉淀即肌原纖維蛋白。采用考馬斯亮藍G-250法測定所提取的肌原纖維蛋白的濃度[16]。

1.2.2 肌原纖維蛋白凝膠的制備 參考文獻[17-18]方法。采用線性升溫方法,吸取15 mL攪拌均勻的肌原纖維蛋白溶液置于直徑25 mm離心管中,用水浴加熱方式以2 ℃/min的速度從25 ℃線性升溫至80 ℃,恒溫保持20 min后取出,快速冷卻至4 ℃,待測。測定前需將凝膠置于室溫下平衡1 h,用于凝膠特性的測定。

1.2.3 單因素試驗設計 選取大豆分離蛋白添加量、肌原纖維蛋白濃度、離子強度和pH對肌原纖維蛋白凝膠特性硬度、彈性和持水性的影響進行研究。

1.2.3.1 大豆分離蛋白添加量對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 將45 mg/mL的肌原纖維蛋白分別加入到大豆分離蛋白含量(2%、4%、6%、8%、10%)的燒杯中,并用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,0.6 mol/L NaCl,pH6.5)將混合蛋白溶液濃度調至40 mg/mL,研究大豆分離蛋白添加量對肌原纖維蛋白凝膠特性硬度、彈性和持水性的影響。

1.2.3.2 肌原纖維蛋白濃度對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 將肌原纖維蛋白稀釋到含量為35、40、45、50、55 mg/mL,然后,分別加入到含6%大豆分離蛋白的燒杯中,并用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,0.6 mol/L NaCl,pH6.5)將混合蛋白溶液濃度調至40 mg/mL,研究肌原纖維蛋白濃度對肌原纖維蛋白凝膠特性硬度、彈性和持水性的影響。

1.2.3.3 離子強度對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 將45 mg/mL的肌原纖維蛋白加入到含6%大豆分離蛋白的燒杯中,并分別用50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,NaCl溶液(0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L),pH6.5的磷酸鹽緩沖液將混合蛋白溶液濃度調至40 mg/mL,研究離子強度對肌原纖維蛋白凝膠特性硬度、彈性和持水性的影響。

1.2.3.4 pH對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 將45 mg/mL的肌原纖維蛋白加入到含6%大豆分離蛋白的燒杯中,并分別用50 mmol/L Na2HPO4,100 mmol/L NaH2PO4,0.6 mol/L NaCl,pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的1.2.3.1磷酸鹽緩沖液將混合蛋白溶液濃度調至40 mg/mL,研究pH對肌原纖維蛋白凝膠特性硬度、彈性和持水性的影響。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上,選取大豆分離蛋白添加量、肌原纖維蛋白濃度、離子強度和pH 4個因素為變量,以凝膠的硬度、彈性和持水性為響應值,應用Design-Expert 8.0 軟件,設計四因素三水平的響應面分析試驗設計。響應面試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels for Box-Behnken design

1.2.5 測定指標

1.2.5.1 凝膠硬度和彈性的測定 將凝膠樣品制成20 mm厚度,直徑為25 mm的圓柱體,在室溫下利用質構儀對肌原纖維蛋白凝膠的硬度和彈性進行測定[19]。探頭類型P/0.5,參數設置:測前速度1.0 mm/s,測定速度0.5 mm/s,測后速度1.0 mm/s,壓縮距離5.0 mm。觸發類型:自動,時間5 s,觸發力5.0 g。

1.2.5.2 凝膠持水性的測定 取5 g于4 ℃條件下保藏24 h的凝膠,精確稱重(M1),移至50 mL離心管中稱重(M2),并于5500 r/min條件下離心15 min。棄上清液后稱重(M3)[20-21]。

凝膠持水性=(M3-M2+M1)/M1

1.3 數據處理

所有數據均為三次重復測定的平均值,結果用平均值±標準差表示。采用Microsoft 2016 Excel進行整理,并用SPSS 19.0和Design Expert 8.0軟件進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 大豆分離蛋白添加量對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 由圖1可知,隨著大豆分離蛋白添加量的增加,凝膠的硬度、彈性及持水性均呈先上升后下降的趨勢;當大豆分離蛋白添加量為6%時,凝膠的硬度、彈性及持水性均顯著高于其他添加量(P<0.05),原因可能是大豆分離蛋白除具有熱凝固性和纖維形成性的優良性狀外還有凝膠化特性,加熱后會增加凝膠強度,但過量添加會造成固形物過多,產生凝結現象導致凝膠品質下降,此結果與羅通彪[22]研究結果一致。張志芳等[14]研究也證實大豆分離蛋白的添加有助于提高肌原纖維蛋白凝膠的硬度、彈性和持水性,與本研究結果一致,本研究所選大豆分離蛋白的添加量為6%。

圖1 大豆分離蛋白添加量對凝膠硬度、 彈性和持水性的影響Fig.1 Effect of soybean protein isolate addition on gel hardness,resilience and water-holding capacity注:同一指標不同小寫字母表示 差異顯著(P<0.05),圖2～圖4同。

2.1.2 肌原纖維蛋白濃度對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 圖2表征了肌原纖維蛋白濃度對獺兔肉肌原纖維蛋白凝膠硬度、彈性和持水性的影響。

圖2 肌原纖維蛋白濃度對凝膠硬度、彈性和持水性的影響Fig.2 Effect of myofibrillar protein concentration on gel hardness,resilience and water-holding capacity

2.1.3 離子強度對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 由圖3可知,蛋白熱誘導凝膠的硬度、彈性隨著離子強度的增加整體呈先增大后減小的變化趨勢,在離子強度為0.7 mol/L時達到最大值;而凝膠持水性隨著離子強度增加變化不顯著(P>0.05)。離子強度也能通過影響肌原纖維蛋白的溶解進而對凝膠的持水性產生作用;同時,在一定范圍內,隨著離子強度的提高,凝膠的硬度、彈性和持水性均呈上升趨勢,但當離子強度高于0.7 mol/L時,硬度減小而彈性趨于穩定,可能是肌原纖維蛋白的溶解度到達臨界值的原因,故本研究所選的離子強度為0.7 mol/L。

圖3 離子強度對凝膠硬度、彈性和持水性的影響Fig.3 Effect of ion concentration on gel hardness, resilience and water-holding capacity

2.1.4 pH對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響 由圖4可看出,pH對肌原纖維蛋白凝膠的硬度、彈性和持水性均有一定影響。其中,凝膠硬度和彈性均隨凝膠形成環境pH的升高呈先增大后減小的變化趨勢,當pH為7.0,硬度和彈性均達到最大值并顯著高于其他pH處理組(P<0.05),原因是當pH接近等電點范圍時,蛋白質分子間疏水作用增強,蛋白溶解度部分或全部喪失,蛋白質分子無序聚集,形成容易滲水且強度較弱的凝膠,引起凝膠硬度和彈性下降[23];凝膠持水性隨pH增大呈緩慢上升趨勢,但差異不顯著(P>0.05),可能是因為較高的pH有利于蛋白之間靜電斥力和蛋白-水作用的增強,本研究所選的pH為7.0。

表2 肌原纖維蛋白凝膠響應面試驗結果Table 2 Response surface design and results of protein gel

圖4 pH對凝膠硬度、彈性和持水性的影響Fig.4 Effect of pH on gel hardness,resilience and water-holding capacity

2.2 響應面優化獺兔肉肌原纖維蛋白凝膠誘導條件優化

2.2.1 響應面優化試驗結果與分析 根據單因素試驗結果,以大豆分離蛋白添加量(A)、肌原纖維蛋白濃度(B)、離子強度(C)和pH(D)為試驗因子,以凝膠硬度(Y1)、彈性(Y2)和持水性(Y3)為響應值,依據Box-Behnken原理進行響應面試驗設計,試驗優化結果見表2。

續表

表3 硬度擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA with hardness

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 各因素對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠硬度的響應面分析試驗

2.2.2.1 模型方程的建立與方差分析 通過Design-Expert軟件對凝膠硬度進行回歸分析,得到如下回歸方程:

Y1=-6927.33+789.37A+52.63B+11589.05C-45.265D-2.94AB-362.30AC+21.96AD-1.03BC+7.92BD+799CD-44.83A2-0.86B2-11187C2-74.57D2

在凝膠硬度回歸模型中,一次項B(P=0.0042)、C(P<0.0001)對方程影響極顯著(P<0.01),交互項AC(P=0.0472)、BD(P=0.0322)和CD(P=0.0309)均對方程影響顯著(P<0.05),二次項A2(P<0.0001)、B2(P=0.0052)、C2(P=0.0008)對方程影響極顯著(P<0.01),D2(P=0.0128)影響顯著(P<0.05),所得各自變量對凝膠硬度的影響程度大小順序為:C>B>A>D。

由表3可以看出，大部分情況下，換相失敗判斷結果與PSCAD運行結果一致，通過本文提出的方法能準確判斷是否發生換相失敗。但如表3中AB兩相經20 Ω電阻相間短路，即將發生或避免發生換相失敗時，出現了判斷結果與實際結果不一致的情況，此時換流器兩側諧波含量較大，判斷換相失敗與否需要計及交流側三次諧波和直流側二次諧波，此時對各換流閥實際觸發角、換相角、熄弧角進行分析。

2.2.2.2 各因素對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠硬度的響應曲面分析 響應面反應兩個變量之間交互作用,以及每個變量水平對響應值的影響程度[24],由此可知各試驗變量間的交互作用對凝膠硬度、彈性和持水性的影響。其中,響應曲面越陡表征該變量對響應值的影響作用越大;響應曲面越平緩表征該變量對響應值的影響越小[25]。

圖5 各因素交互作用對肌原纖維蛋白凝膠硬度顯著影響的響應面Fig.5 Response surface of the interactive effects of factors on the gel hardness

如圖5a～圖5c所示,大豆分離蛋白添加量和離子強度、蛋白濃度和pH以及離子強度和pH之等兩兩之間的交互作用均對凝膠硬度有顯著影響,其他交互項均無顯著影響(文中未列出)。凝膠硬度隨大豆分離蛋白添加量增加呈上升趨勢且響應曲面的坡面逐漸變陡,原因可能是大豆分離蛋白的凝膠性可以將蛋白溶膠基質“固化”形成具有一定機械強度的網狀結構,有效提高了肌原纖維蛋白凝膠的硬度,從而防止已形成的乳化肉糜在加熱過程中被破壞[26]。但隨著離子強度的增強,硬度呈先上升后下降的變化,當離子強度為0.70 mol/L左右時,凝膠硬度最好,說明離子強度對肌原纖維蛋白凝膠的硬度具有較大影響,離子強度主要通過影響分子的聚集行為和聚集體的大小對凝膠特性造成影響[27],過高或過低的離子強度均不利于凝膠網狀結構的形成和穩定,本研究與Bertram等[12]研究一致。同時,肌原纖維蛋白濃度與pH之間的交互作用對凝膠硬度也有顯著影響,凝膠硬度隨蛋白濃度和pH增加整體呈先上升后下降的變化趨勢,當pH為6.80以及蛋白濃度為51.0 mg/mL左右時,凝膠的硬度最好;且離子濃度與pH之間的交互作用也對凝膠硬度有顯著影響,隨著pH的增大,凝膠硬度呈顯著上升變化,但隨著離子強度的增大,凝膠硬度呈下降趨勢且響應曲面逐漸變陡。

表4 彈性擬合二次多項式模型方差分析Table 4 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA with resilience

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.3 各因素對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠彈性的響應面分析試驗

2.2.3.1 模型方程的建立與顯著性檢驗 通過Design-Expert軟件對凝膠彈性進行回歸分析,得到如下回歸方程:

Y2=-9.59+0.29A+0.11B+10.19C+0.79D+8.00E-004AB+0.055AC+0.025AD-0.035BC-5.00E-003BD+1.41CD-0.04A2-5.41E-004B2-13.61C2-0.12D2

表5 持水性擬合二次多項式模型的方差分析Table 5 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA with water-holding capacity

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

在凝膠彈性回歸模型中,一次項A(P=0.0062)對方程影響極顯著(P<0.01),C(P<0.0401)對方程影響顯著(P<0.05),交互項CD(P=0.0450)對方程影響顯著(P<0.05),二次項A2(P=0.0043)對方程影響極顯著(P<0.01),C2(P=0.0171)和D2(P=0.0316)對方程影響顯著(P<0.05),所得各自變量對凝膠彈性的影響程度大小順序為:A>C>B>D。

2.2.3.2 各因素對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠彈性的響應曲面分析 由圖6,交互項蛋白濃度和離子強度之間的相互作用對凝膠彈性有顯著影響,其他交互項均無顯著影響(文中未列出)。分析CD交互影響的響應面圖可知,離子強度與pH的交互作用較強,隨著離子強度和pH的增大凝膠彈性呈先上升后下降的變化趨勢,且響應曲面的坡面逐漸變陡,當離子強度為0.65～0.70 mol/L,pH在6.5～7.0范圍內時,凝膠具有較好的彈性。pH主要通過影響蛋白體系靜電荷的數量,蛋白表面的靜電荷越多,靜電斥力越大,所形成的凝膠為線性聚集體結構,較不穩定[28]。

圖6 pH和離子強度交互作用對肌原纖維蛋白 凝膠彈性影響的響應面Fig.6 Response surface of the interactive effects of pH and ion concentration on resilience

2.2.4 各因素對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠持水性的響應面分析試驗

2.2.4.1 模型方程的建立與顯著性檢驗 通過Design-Expert軟件對凝膠持水性進行回歸分析,得到如下回歸方程:

Y3=-8.43+0.30A+0.11B+9.04C+0.76D-6.45E-004AB-0.0685AC+0.01AD+0.03BC-6.58E-003BD+0.02CD-0.023A2-7.6517E-004B2-7.59C2-0.036D2

在凝膠持水性回歸模型中,一次項A(P<0.0001)、C(P=0.0024)對方程影響極顯著(P<0.01),B(P=0.0446)對方程影響顯著(P<0.05),BD(P=0.0107)對方程影響顯著(P<0.05),二次項A2(P=0.0001)、B2(P=0.0007)和C2(P=0.0007)也均對方程影響極顯著(P<0.01),所得各自變量對凝膠硬度的影響程度大小順序為:A>C>B>D。

2.2.4.2 各因素對肌原纖維蛋白熱誘導凝膠持水性的響應曲面分析 如圖7,交互項蛋白濃度和離子強度之間的相互作用對凝膠持水性有顯著影響,其他交互項均無顯著影響(文中未列出)。分析BD交互影響的響應面圖可知,隨著肌原纖維蛋白濃度和pH的增大,凝膠持水性呈上升的變化趨勢且響應曲面的坡面逐漸變陡,主要因為pH的增大,導致蛋白體系內蛋白所含靜電荷增加,靜電斥增大,蛋白質結合水的能力也隨之增強,進而導致持水性的增強。同時,隨著肌原纖維蛋白濃度的增大,凝膠的持水性也逐漸增大,原因是溶解的蛋白質含量的增多,有利于高密度蛋白形成緊密且穩定的立體網狀結構,說明蛋白濃度的增加有利于提高凝膠的持水性。

圖7 pH和蛋白濃度交互作用對肌原纖維蛋白 凝膠持水性影響的響應面Fig.7 Response surface of the interactive effects of pH and protein concentration on the water-holding capacity

2.3 獺兔肌原纖維蛋白熱誘導凝膠最佳制備條件的預測及驗證

響應面圖形分別是由大豆分離蛋白添加量、肌原纖維蛋白濃度、離子強度和pH等因子之間的交互作用對凝膠硬度、彈性和持水性等響應值的影響程度構成的三維網絡結構圖,對回歸方程進行求解,可預測得到最優的凝膠硬度、彈性和持水性數值,當大豆分離蛋白添加量為6.28%、肌原纖維蛋白濃度為51.22 mg/mL、離子強度為0.67 mol/L、pH為6.87時,肌原纖維蛋白獲得最佳的凝膠特性,此時最大硬度值為508.44 g、彈性為0.35、持水性為0.91。為了比較實際測定值和預測值之間的準確性,考慮到實際工作的可操作性,將最優的預測實驗條件進行修正并對模型進行實際驗證。確定肌原纖維蛋白凝膠最佳制備條件為:大豆分離蛋白添加量6.30%、肌原纖維蛋白濃度51.0 mg/mL、離子強度0.67 mol/L、pH6.85。在此參數下制得的凝膠特性指標為:硬度508.435 g、彈性0.337、持水性0.896,與理論值的相對誤差分別為0.70%、3.44%、1.58%。說明回歸方程能較真實地反應各因素對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響,用響應面法優化獺兔肌原纖維蛋白凝膠最佳誘導工藝所制凝膠特性較好。

3 結論

采用水浴加熱線性升溫法制備肌原纖維蛋白凝膠,在單因素試驗基礎之上,以凝膠硬度、彈性和持水性為響應值,建立了評價獺兔肉肌原纖維蛋白凝膠特性的二次多項式模型。結果證明利用響應面確定的該模型是合理的,能用來較好地預測肌原纖維蛋白的凝膠特性。

通過模型分析和實驗修正后得到肌原纖維蛋白熱誘導凝膠最佳工藝條件為:大豆分離蛋白添加量6.30%、肌原纖維蛋白濃度51.0 mg/mL、離子強度0.67 mol/L、pH6.85,所得凝膠特性指標硬度為508.435 g、彈性為0.337、持水性為0.896。在此最佳工藝條件下的響應值與模型預測值相比,相對誤差分別為硬度0.70%、彈性3.44%、持水性1.58%,說明本研究方法所制凝膠品質較好。