枸杞總黃酮提取工藝優化及其體外抗氧化活性分析

祿 璐,米 佳,羅 青,李越鯤,梁曉婕,閆亞美

(寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所,寧夏銀川 750002)

黃果枸杞是近年來新發掘的枸杞品種,屬于寧夏枸杞的變種[1],果實呈黃色,酸甜可口,含氨基酸、多糖、類胡蘿卜素、多酚等多種營養及功效成分,目前主要集中在寧夏地區示范推廣種植[2-3]。

黃酮是一類重要的天然有機化合物,結構復雜多樣,具有很強的藥理作用。大量研究表明,黃酮類化合物具有較強的抗氧化作用,可廣泛影響心血管系統、免疫系統和消化系統[4-7],對保護肝損傷亦有顯著療效[8]。黃果枸杞富含黃酮類化合物,如蘆丁、柚皮素、香葉木素、兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等。一般提取黃酮的方法有水提法、醇提法、超聲波/微波輔助提取法、亞臨界乙醇提取法、生物酶提取法等等[9-11],通過對溶劑的選擇、提取水溫、提取時間的調控與優化,提高黃酮得率[12-14]。但目前由于黃果枸杞尚未形成規模化種植和管理,因此,黃果枸杞的諸多基礎研究,如功效成分的提取與鑒定、功效評價等方面的工作還未開展。

本研究基于黃果枸杞中豐富的黃酮物質,采用響應面方法優化黃酮提取工藝,并對不同種質枸杞黃酮提取物進行體外抗氧化活性測定分析,以期為枸杞的基礎研究及資源的開發利用提供科學依據和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃果枸杞(“寧農杞4號”、“寧農杞5號”、“寧夏黃果”)、紅果枸杞(“寧杞1號”)、黑果枸杞 國家枸杞工程技術研究中心種質資源圃(寧夏,銀川),經國家枸杞工程技術研究中心種質資源室鑒定。取樣時,隨機摘取枸杞樹不同位置的果實,果實八成熟,并保持成熟度相對一致,采后迅速置于-80 ℃超低溫冰箱速凍備用;維生素C、沒食子酸、蘆丁標準品 成都曼思特生物科技有限公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、福林酚、丙酮、濃鹽酸、醋酸鈉、冰乙酸、過硫酸鉀、ABTS、DPPH、甲醇、三吡啶三吖嗪(TPTZ)等 均為國產分析純。

BS224S分析天平 德國賽多利斯公司;TU1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;恒溫水浴鍋 北京長源實驗設備廠;SHZ-D(Ⅲ)循環水式多用真空泵 天津華鑫儀器廠;全數字超聲波發生器 武漢嘉鵬電子有限公司;Centrifuge 5810 R冷凍型臺式大容量高速離心機 德國艾本德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃果枸杞黃酮提取工藝優化 以“寧農杞5號”黃果枸杞作為優化提取黃酮工藝的試驗材料。稱取超低溫速凍的黃果枸杞3.0 g于研缽中,迅速研磨至果泥狀,轉入燒杯中,加入一定濃度、一定體積倍數的乙醇溶液溶解,攪拌混合均勻后在一定的水浴溫度下加熱一定時間,再置于300 W超聲波下輔助提取30 min,冷卻后,3000 r/min離心5 min,取上清液,得到黃酮提取液,隨即測定總黃酮的含量。

1.2.2 單因素試驗 采用控制變量法,按照1.3.1黃酮提取工藝,考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、乙醇體積倍數(乙醇添加體積與樣品質量的倍數,10、20、30、40、50)、水浴溫度(40、50、60、70和80 ℃)、水浴時間(30、50、70、90和110 min,)對提取總黃酮含量的影響。考察某一因素時,其他因素條件固定為:乙醇濃度70%,乙醇體積倍數40,水浴溫度70 ℃,水浴時間90 min。

1.2.3 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上,利用Design-Expert 8.06軟件Box-Behnken 設計,進行響應面優化設計,以乙醇濃度(A)、乙醇體積倍數(B)、水浴溫度(C)、水浴時間(D)為因變量,以總黃酮含量為響應值,設計四因素三水平響應面優化試驗,中心試驗重復5 次,共29 組試驗,具體如表1所示。

表1 Box-Behnken設計因素與水平表Table 1 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

1.2.4 黃果枸杞黃酮提取物體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 黃果枸杞黃酮提取物成分測定 以三種種質黃果枸杞為研究對象,以紅果枸杞(寧杞1號)、黑果枸杞為對照組,按照優化后的黃酮提取方法,進行黃酮化合物提取,并對不同種質的黃酮提取物進行總黃酮、總酚含量的測定。

總黃酮含量采用硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量[15]。取提取液10 mL于25 mL容量瓶中,加5% NaNO2溶液0.5 mL搖勻,放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL搖勻,放置6 min,加4% NaOH 4 mL,再用30%乙醇定容,搖勻,放置10 min,于510 nm處測定樣品吸光值。以不同濃度蘆丁標準品溶液繪制所得標準曲線為:y=0.1066x-0.0017,R2=1.0000,x為吸光值,y為蘆丁含量(μg/mL),以此計算樣品中總黃酮的含量(μg/g 鮮重,以蘆丁計)。

總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法測定[16]。稱取2.00 g樣品于250 mL圓底燒瓶,加入40 mL體積分數60%乙醇溶液,攪拌均勻,在恒溫水浴鍋中75 ℃水浴,提取50 min。提取液以3000 r/min離心200 min,取上清液1 mL加入福林酚試劑1 mL,搖勻后再加入質量分數12% Na2CO3溶液2 mL,用水定容至25 mL,搖勻,室溫下避光反應2 h后,765 nm波長下測定吸光值。同法制備不同濃度沒食子酸標準溶液,繪制所得標準曲線為:y=0.0904x+0.0012,R2=0.9982,x為吸光值,y為沒食子酸含量(μg/mL),并由此計算總酚含量(mg/g鮮重,以沒食子酸計)。

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力測定 參照Oyaizu[15]測定方法。將7 mmol/L ABTS+溶液與2.45 mmol/L K2S2O8混合,置于暗處反應16 h制成ABTS+儲備液,用甲醇稀釋ABTS+溶液至吸光度為0.70±0.02(波長734 nm)制成ABTS+工作液。取30 μL黃酮提取液,加入3 mL ABTS+溶液渦旋10 s混勻,6 min后測量其在波長734 nm處的吸光度,ABTS+清除率(A)計算公式如下:

式中:A2為加入提取物的吸光度;A1為本底吸收的吸光度;A0為空白溶液的吸光度。

配置不同濃度VC標品溶液,以VC的質量(mg)為橫坐標,清除率(%)為縱坐標,得到VC清除ABTS+自由基的標準曲線,y=9959.4485x-0.4185,R2=0.9934。將樣品清除率代入標曲,結果表示為每克鮮黃果枸杞的VC當量(mg VCeq./g鮮重)。

1.2.4.3 DPPH自由基清除能力測定 參照Atoui[16]測定方法。吸取黃酮提取液0.5 mL,加入 0.1 mmol/L DPPH自由基溶液4.0 mL,用甲醇定容至6 mL搖勻,放置30 min。以60%甲醇調零,517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率(B)計算公式如下:

式中:A2為加入提取物的吸光度;A1為本底吸收的吸光度;A0為空白溶液的吸光度。

以VC的質量(mg)為橫坐標,清除率(%)為縱坐標,得到VC清除DPPH自由基的標準曲線,y=2454.2697x-1.7252,R2=0.9932。將樣品清除率代入標準曲線,結果表示為每克鮮黃果枸杞的VC當量(mg VCeq./g鮮重)。

1.2.4.4 還原力測定(FRAP) 參照Wang[17]測定方法。取10 mmol/L TPTZ溶液 10 mL,0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)100 mL,20 mmol/L的FeCl3溶液10 mL 混合均勻后置于35 ℃水浴中孵化30 min后使用,現用現配。吸取不同濃度VC標準品溶液0.1 mL,加入TPTZ工作液0.9 mL,醋酸鈉緩沖液9 mL。于35 ℃水浴中反應30 min,分別測定597 nm 波長處吸光值,FRAP值以吸光值表示。

以VC的質量(mg)為橫坐標,吸光值為縱坐標,得到VC標準溶液FRAP標準曲線,y=24.5559x+0.0411,R2=0.9933。樣品的測定方法同標曲,將樣品吸光值代入標曲,結果表示為每克鮮黃果枸杞的VC當量(mg VCeq./g 鮮重)。

1.2.5 相關性分析 分析比較不同黃果枸杞黃酮提取物的抗氧化活性與其總黃酮、總酚含量的相關性。

1.3 數據處理

采用SPSS 21.0統計軟件、Origin 8.5繪圖軟件進行數據方差顯著性處理和分析,測定數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響 如圖1所示,總黃酮含量隨著提取劑乙醇濃度的增大而升高,當乙醇濃度為70%時,總黃酮含量最高;當其濃度大于70%時,總黃酮含量逐漸減少。黃酮類物質在一定的乙醇-水體系下容易溶出,而當乙醇濃度過大時,其他醇溶性色素、親脂溶性物質溶出增多,這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子結合[9-10],從而抑制黃酮類物質的溶出,導致總黃酮含量下降。

圖1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on total flavonoids content注:圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖2～4同。

2.1.2 乙醇體積對總黃酮含量的影響 提取溶劑的量是提取天然產物過程中尤為重要的因素之一。如圖2所示,隨著乙醇體積的增加,總黃酮含量呈現先升高后下降趨勢,這表明溶劑體積的增加,能夠促進物料和溶劑更加充分的接觸和反應,使黃酮類物質更易溶出;當乙醇體積倍數達到40時,提取的總黃酮含量最高。

圖2 乙醇體積對總黃酮含量的影響Fig.2 Effects of ethanol volume on total flavonoids content

圖3 水浴溫度對總黃酮含量的影響Fig.3 Effects of water bath temperature on total flavonoids content

2.1.3 水浴溫度對總黃酮含量的影響 如圖3所示,隨著水浴溫度從40 ℃向70 ℃升高,總黃酮含量隨之升高,當溫度達到80 ℃時,黃酮含量略微下降(但不顯著),適當水浴升溫可增加分子動能,增強滲透擴散能力,利于物質溶出。因此,水浴溫度應控制在70 ℃。

2.1.4 水浴時間對總黃酮含量的影響 總黃酮含量隨著水浴時間延長而不斷升高,當高于90 min后,總黃酮含量顯著下降,分析原因可能是由于水浴時間過長,乙醇揮發較多,使總黃酮的提取下降,也可能是黃酮類物質已經基本溶出,此時延長水浴時間,不僅引起其他物質溶出,還會使部分熱敏化合物發生降解反應[17-18]。

表2 響應面優化試驗結果Table 2 Results of response surface experiments

圖4 水浴時間對總黃酮含量的影響Fig.4 Effects of water bath time on total flavonoids content

2.2 響應面試驗結果分析

基于單因素試驗確定的適宜范圍,依據響應面試驗設計原理,設計四因素三水平黃果枸杞黃酮提取優化試驗,共29組試驗,試驗結果如表2所示。

經Design-Expert 8.06軟件回歸擬合,建立提取工藝參數回歸模型,得到總黃酮含量(Y)對乙醇濃度(A)、乙醇體積倍數(B)、水浴溫度(C)、水浴時間(D)的二次多項回歸方程:Y=175.22+0.43A+3.36B+29.44C-2.57D-7.09AB+23.10AC+13.64AD+3.27BC+8.93BD-2.17 CD-22.15A2-14.2B2-41.75C2-32.65D2。

對上述回歸方程進行方差分析及顯著性檢驗,如表3所示。結果表明:回歸方程模型極顯著(P<0.01);失擬項不顯著(P>0.05),模型相關系數為0.9957,調整確定系數為0.9914,預測模型系數為0.9873,說明模型與實際試驗擬合程度良好,誤差較小,模型成立,可用來優化分析、預測黃果枸杞黃酮提取工藝及其含量。

除乙醇濃度因素不顯著外,體積倍數(B)、水浴溫度(C)、水浴時間(D)均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01);各因素對提取總黃酮的影響強弱順序依次為:水浴溫度(C)>乙醇體積倍數(B)>水浴時間(D)>乙醇濃度(A)。其中,乙醇濃度與體積倍數(AB)、乙醇濃度與水浴時間(AD)、乙醇濃度與水浴溫度(AC)、體積倍數與水浴時間(BD)因素之間交互作用極顯著(P<0.01),如圖5所示。

由Design-Expert 8.06軟件預測出的最佳提取工藝參數為:乙醇濃度為72.10%、體積倍數為41.17、水浴溫度為72.08 ℃、水浴時間為90.13 min,此條件下,總黃酮含量為181.556 μg/g,為驗證模型的可靠性,考慮到實際操作條件,調整工藝參數為:乙醇濃度70%、體積倍數40倍、水浴溫度70 ℃、水浴時間90 min,進行五組試驗,得到總黃酮含量為(175.21±1.69) μg/g,理論值與預測值相差3%,誤差較小,說明此模型可以有效用于黃果枸杞中的黃酮提取工藝優化。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗和結果Table 3 Test of significance for regression coefficient and results

注:**表示差異極顯著,P<0.01;*表示差異顯著,P<0.05。

圖5 黃酮提取優化試驗響應面圖Fig.5 Response surface plots for flavonoids extraction yield

2.3 體外抗氧化活性分析

2.3.1 不同枸杞抗氧化活性分析 “寧農杞4號”、“寧農杞5號”和“寧夏黃果”是黃果枸杞品系中最具代表性的三個品種,以紅果枸杞(“寧杞1號”)和黑果枸杞作為對照組,均按照上述“寧農杞5號”響應面優化后的黃酮最佳提取方法制備,獲得不同品種枸杞黃酮提取液,并比較不同品種枸杞黃酮提取物的抗氧化活性,結果如圖6所示。對ABTS自由基的清除能力由強到弱依次為:黑果枸杞>寧農杞5號>寧夏黃果>寧杞1號>寧農杞4號,其中寧夏黃果與寧杞1號差異不顯著(P>0.05),DPPH清除能力結果與ABTS結果一致;Fe3+還原能力由強到弱依次為:黑果枸杞>寧杞1號>寧農杞4號>寧農杞5號>寧夏黃果,其中寧農杞4號、寧農杞5號和寧夏黃果差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同枸杞黃酮提取物體外抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of antioxidant activity of flavonoids extract from different wolfberry in vitro

將上述抗氧化活性結果轉換化成VC當量,得到表4,結合圖6可知,五種枸杞中,黑果枸杞和“寧農杞5號”黃果枸杞具有較強的清除ABTS+和DPPH自由基的能力。

表4 不同抗氧化指標對應的VC當量 Table 4 VC equivalent of different antioxidant indexes

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 不同抗氧化活性與活性成分的相關性分析 由表5可知，三種黃果枸杞中,“寧農5號”總黃酮及總酚含量最高,其中總黃酮含量是其他兩種黃果枸杞的1.4～2.3倍,是紅果枸杞的1.7倍,對照組紅果枸杞(“寧杞1號”)總酚含量最低。黑果枸杞由于其種質特殊性,含有豐富且獨特的花色苷成分,因此總黃酮和多酚含量在幾種枸杞果實中含量最高。已有研究表明,不同黃酮化合物組成對抗氧化活性影響較大,酚羥基及內氫鍵數目是黃酮類化合物表現抗氧化活性的重要影響因素,7-O位黃酮衍生物具有較母體化合物強的生物活性,特別是山奈酚衍生物和槲皮素衍生物,是黃酮類化合物表現抗氧化、抗癌等生物活性的重要物質組成[18-20],但目前黃果枸杞中的黃酮組成還不明晰,有待進一步研究。

表5 不同枸杞黃酮提取物組成Table 5 Compose of flavonoids extract of different wolfberry

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表6 不同枸杞黃酮提取物組成與抗氧化能力的相關性Table 6 Correlation between flavonoids extract and antioxidant capacity of different wolfberry

注:表中“*”表示相關性顯著(P<0.05);“**”表示相關性極顯著(P<0.01)。

如表6所示,總黃酮含量與ABTS+清除率呈顯著正相關(P<0.05),相關系數為0.909,與DPPH清除率和FRAP呈極顯著正相關(P<0.01)相關系數分別為0.992和0.969;總酚含量與ABTS+清除率、DPPH清除率呈顯著正相關(P<0.05),相關系數分別為0.903和0.907。綜合表明,黃酮是黃果枸杞表現抗氧化活性的主要成分[21-22]。

3 結論

黃酮類化合物是黃果枸杞功效物質的重要組成,試驗結果表明,水浴溫度是影響黃果枸杞黃酮提取的主要因素,最佳提取工藝參數為:乙醇濃度70%、乙醇體積倍數40倍、水浴溫度70 ℃、水浴時間90 min,此時黃酮含量為(175.21±1.69)μg/g;體外抗氧化活性分析表明,黃果枸杞中“寧農杞5號”對ABTS+清除率和DPPH清除能力最強,高于紅果枸杞(“寧杞1號”),但不及黑果枸杞;通過相關性分析可知,總黃酮含量與ABTS+清除率呈顯著正相關,與DPPH清除率和FRAP值呈極顯著正相關;總酚含量與ABTS清除率、DPPH清除率呈顯著正相關。綜合表明,黃酮類化合物是黃果枸杞表現抗氧化活性的主要成分。后續將對黃果枸杞中的黃酮化合物進行進一步分離鑒定,為黃果枸杞的綜合開發與利用提供理論支撐。