鷹嘴豆中植物甾醇的提取工藝優化及其抑菌活性

,2,2,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083; 2.農業部農業轉基因生物安全評價(食用)重點實驗室,北京 100083; 3.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(北京),北京 100083)

鷹嘴豆(CicerarietinumLinn)是豆科一年生草本植物。別名雞頭豆。鷹嘴豆種子長5～9 mm,直徑4～7 mm。氣無,味淡,質地堅硬,表面呈現淡白色或微紅色。種臍附近有喙狀突起,形似鷹頭。其栽培歷史悠久,可追溯至9500年前的亞洲西部和地中海沿岸。目前主要分布在較為溫暖干旱的地區,是世界第二大消費豆類,也是栽培面積較廣的食用豆類作物之一[1]。

鷹嘴豆富含多種植物蛋白、碳水化合物、粗纖維、異黃酮及鈣、鎂、鐵等成分,其蛋白質功效比、氨基酸的含量以及消化率等均優于其他豆類[2]。鷹嘴豆具有非常高的食用價值,目前,國內外的學者研究發現,食用鷹嘴豆及其相關產品可以降低血清血脂水平,同時減少膽固醇的累積,對于心腦血管疾病等具有明顯的預防作用[3-5]。鷹嘴豆具有低淀粉、較高粗纖維含量的特征,因此是糖尿病患者的理想食品。其蛋白質降解產物具有顯著的抗氧化作用,對治療便秘和預防直腸癌具有積極作用[6-8]。也有大量研究證明鷹嘴豆在降血脂、降血糖等方面具有明顯的效果[9-11]。例如傅櫻花等考察了鷹嘴豆酸奶(CY)和鷹嘴豆粗黃酮(CCFE)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠降血糖活性,其結果表明鷹嘴豆酸奶(CY)可能與增強肝糖原合成能力有關,從而降低糖尿病小鼠模型的血糖[12];張澤生等研究了鷹嘴豆中D-松醇對STZ誘導的II型糖尿病小鼠的降血糖功效,其結果表明鷹嘴豆中D-松醇可有效改善患病小鼠糖耐量,降低患病小鼠的空腹血糖,同時具有一定修復肝損傷的功效[13]。姚余祥等人以鷹嘴豆為原材料,制備了降膽固醇活性肽,其在動物實驗中證明具有一定效果[14]。

隨著生命科學、食品工程及油脂科學與工程技術的高速發展,甾醇類物質在食品、化工、飼料和醫藥等多個領域得到了人們廣泛的關注和重視。現已有許多研究證實從一些物質中提取出的植物甾醇具有良好的抑菌效果[15],但國內外對鷹嘴豆中植物甾醇作用的研究尚未見報道。因此,本文擬將超聲波提取法和柱吸附法相結合,優化鷹嘴豆中植物甾醇的提取,純化提取產物,并進一步鷹嘴豆中植物甾醇對常見菌種的抑制作用及程度,旨在為鷹嘴豆中甾醇的綜合利用以及研發一些新型食品添加劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆 當地市場;大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌 中國農業大學食品科學與營養工程學院轉基因生物安全評價(食用)重點實驗室;甾醇標準品(膽固醇、膽甾烷醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇)、青-鏈霉素混合液N-甲基-N-三甲基硅烷基七氟丁酰胺、1-甲基咪唑 美國Sigma公司;柱層析硅膠、六水合三氯化鐵、氫氧化鉀、乙酸乙酯、無水乙醇、石油醚、無水乙醚、磷酸 均為分析純,西亞試劑。

JY98-IIIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;101-0ES型電熱鼓風干燥箱 上海科恒實業發展有限公司;LGJ-25C型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;FW100型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;TGL-16M臺式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司;Varioskan Flash全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;GC6890-MS5973氣相色譜質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 將鷹嘴豆清洗、烘干后,使用粉碎機粉碎,過40目篩并收集篩下豆粉,用于后續實驗。

1.2.2 超聲波輔助提取單因素實驗 選擇乙酸乙酯為提取溶劑,使用超聲波細胞破碎儀進行植物甾醇的提取,稱取5.0 g鷹嘴豆粉。固定液料比10∶1 mL/g,提取時間7 min,選取超聲功率分別為250、300、350、400、450 W進行試驗,考察超聲功率對植物甾醇提取率的影響。在液料比為10∶1 mL/g,超聲功率300 W的條件下,選取提取時間分別為3、5、7、9、11 min進行試驗,考察提取時間對植物甾醇提取率的影響。在超聲功率300 W,提取時間為7 min的條件下,選取液料比分別為5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1 mL/g進行試驗,考察液料比對植物甾醇提取率的影響。

1.2.3 響應面優化試驗 在單因素實驗條件初步確定的基礎上,以超聲功率、提取時間、液料比為自變量,以鷹嘴豆中植物甾醇的提取率為評定響應值,進行三因素三水平的響應面分析試驗。試驗水平與因素設定見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

用二階多項模型對獨立變量與響應值之間的相互關系進行擬合,進一步預測最佳制備條件。

式中,Y為預測值,即粗提物中植物甾醇提取率的預測值。A0為回歸系數,Ai與Aii分別是對Xi的一次和二次效應,Aij表示Xi與Xj之間的線性交互效應。

1.2.4 植物甾醇提取率的測定 使用比色法檢測粗提物中植物甾醇的含量[16-17]。

1.2.4.1 標準曲線的制作 使用少量無水乙醇將100 mgβ-谷甾醇標準品溶解,并轉入100 mL容量瓶中定容。使用前稀釋10倍,即母液質量濃度為0.1 mg/mL。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL的0.1 mg/mLβ-谷甾醇溶液于試管中,繼續添加無水乙醇至4.0 mL,加入2.0 mL硫磷鐵顯色劑,振蕩搖勻,15 min后在波長538 nm處測定其吸光度值。以β-谷甾醇溶液質量濃度(單位為mg/mL)為橫坐標,以吸光度值(A)為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.4.2 提取率的計算 記鷹嘴豆粉干重為m1(單位為g),超聲波輔助提取得到的粗提物總質量為m2(單位為mg),稱取質量為m3(單位為mg)粗提物溶于4.0 mL無水乙醇,并加入2.0 mL硫磷鐵顯色劑,總體積為6 mL。室溫下振蕩搖勻,經15 min冷卻后在波長538 nm處檢測其吸光度值,代入標準曲線中,算得粗提物中植物甾醇質量濃度值c1,按下述公式計算植物甾醇提取率C(單位為mg/100 g·dw)。

1.2.5 植物甾醇的分離純化 將1.2.3的優化實驗條件后提取得到的粗提物分離純化。預先使用無水乙醇配制成濃度0.1 mg/mL的醇溶液。采用硅膠柱層析法進行分離純化,具體步驟為:取約8.0 g的層析硅膠,110 ℃下活化10 min后濕法裝柱。加入樣品后,靜置1 h使固定相充分吸附甾醇樣品,使用體積比為10∶1的石油醚-無水乙醚流動相體系進行洗脫,控制流速在1 mL/min左右,收集洗脫產物[18]。旋轉蒸發揮干有機溶劑后,使用硫磷鐵法檢測植物甾醇得率。

1.2.6 植物甾醇的種類鑒定 使用氣相色譜質譜聯用法(GC-MS)對分離純化后的樣品進行種類鑒定,以明確主要甾醇的種類及其所占比例。取1 mL純化后的樣品,加入20 μg膽甾烷醇作為內標,加入2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液2 mL,渦旋振蕩1 min混勻。70 ℃水浴振搖45 min,室溫冷卻。加入二氯甲烷5 mL,超純水3 mL,混合均勻,8000 r/min離心5 min棄上清,再用5 mL超純水洗三次,棄上清,氮氣吹干有機相,4 ℃貯存備用。

稱取各甾醇標準品5 mg(β-谷甾醇10 mg),分別用丙酮配制濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的甾醇混合標準溶液,氮吹吹干后,甾醇混合標準溶液與提取的甾醇樣品中均加入100 μL衍生劑(N-甲基-N-三甲基硅烷基七氟丁酰胺∶1-甲基咪唑=95∶5,v/v)于75 ℃衍生20 min,使用正己烷定容至1 mL,用于GC-MS檢測。

色譜條件:使用J&W DB-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),升溫程序:100 ℃保持1 min,以10 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;載氣(He)流速1.0 mL/min,壓力2.4 kPa,進樣1.0 μL,不分流。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;傳輸線溫度290 ℃;離子源溫度250 ℃;質量掃描范圍m/z 35～500;監測方式SIM模式。

以甾醇混合標準溶液濃度為橫坐標,以各甾醇峰面積(經內標校正)為縱坐標,繪制標準工作曲線,用標準工作曲線對試樣進行定量,得到其檢測濃度。

1.2.7 植物甾醇的抑菌活性的測定 采用抑菌圈法測定分離純化后植物甾醇的抑菌活性[19-20]。將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以劃線法分別接種于LB培養基中,并置于37 ℃培養箱中培養18～24 h。分別挑取單菌落,接種于LB液體培養基中,37 ℃搖床中(200 r/min)培養至菌數達對數生長期。取四種菌液體培養基1 mL于9 mL生理鹽水中,制成菌懸液,置于4 ℃冰箱中保存。

以青-鏈霉素混合液(1 mg/mL)作為陽性對照,以丙酮配制成的甾醇樣品(1、2 mg/mL)與甾醇標準品(β-谷甾醇,1 mg/mL)為處理組,以丙酮作為陰性對照。在無菌條件下取100 μL菌懸液均勻涂布于LB培養基平板。用無菌鑷子夾取滅菌的牛津杯于培養基上,分別取100 μL丙酮溶液、青-鏈霉素混合液、甾醇樣品與甾醇標準品于牛津杯中,37 ℃培養24 h。用無菌鑷子去除牛津杯,游標卡尺測量三次抑菌圈直徑,記錄數據。

1.3 數據處理

使用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面實驗的設計與數據分析,擬合得到二元方程并繪制三維響應曲面。使用SPSS 17.0進行數據的顯著性分析,采用單因素方差分析評價統計參數,使用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 標曲的建立β-谷甾醇溶液質量濃度(單位為mg/mL)與吸光度值的標準曲線如圖1所示,標曲方程為Y(Abs)=10.103X+0.0432,決定系數R2=0.9871。

圖1 植物甾醇濃度標準曲線Fig.1 Standard curve of concentration of phytosterol

2.1.2 單因素實驗結果

2.1.2.1 超聲功率對植物甾醇提取率的影響 由圖2可知,當超聲功率為250～400 W時,植物甾醇提取率變化不顯著,而當功率繼續升高至450 W時,甾醇提取率隨功率的增大而顯著增大(P<0.05),這說明超聲功率對甾醇含量影響較大。考慮到變幅桿所能承受的最大功率為450 W,選擇350、400、450 W三個水平用于后續優化實驗。

圖2 超聲功率對甾醇提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of phytosterols

2.1.2.2 提取時間對植物甾醇提取率的影響 由圖3可知,當提取時間為3～11 min時,植物甾醇提取率呈現出先增大再減小的變化趨勢,在9 min時達最大,顯著高于其它組(P<0.05)。因此選擇7、9、11 min三個水平用于后續優化試驗。

圖3 提取時間對甾醇提取的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield of phytosterols

2.1.2.3 液料比對植物甾醇提取的影響 由圖4可知,液料比為8∶1 mL/g時提取率顯著高于5∶1 mL/g(P<0.05),但與10∶1、12∶1 mL/g之間無顯著差異,整體上呈現出先增大再減小的變化趨勢。因此選擇5∶1、8∶1、10∶1 mL/g三個水平用于后續優化試驗。

圖4 液料比對甾醇提取的影響Fig.4 Effect of ratios of liquid to material on extraction yield of phytosterols

2.2 響應面法優化提取工藝條件

2.2.1 響應面法設計及實驗結果 響應面法設計及實驗結果見表2。

表2 響應面法設計及試驗結果Table 2 Response surface methodology design with their observed responses

使用Design-Expert 8.0.6對表2的實驗結果進行分析,以總甾醇含量為響應結果,對超聲功率(W)、提取時間(min)、液料比(mL/g)建立二元多項回歸模型并對其所得數據進行分析,得到的回歸分析結果見表3,相應回歸方程為:

由表3可知,三因素中超聲功率與液料比均對提取率具極顯著影響(P<0.01),提取時間對甾醇得率無顯著影響(P>0.05);超聲功率的二次項(A2)對提取率有顯著影響(P<0.05);植物甾醇的提取率隨超聲功率與液料比的增加均呈現出持續增大的變化趨勢。由F值可知,影響超聲波—乙酸乙酯提取鷹嘴豆植物甾醇的因素主次順序為:超聲功率>液料比>提取時間。

植物甾醇提取率的三維響應曲面如圖5所示。三維響應圖中等高線的形狀可以表明超聲功率、提取時間和液料比之間的交互效應對響應值的影響,橢圓形表示兩因素交互作用顯著。由此可知,以上三種因素的兩兩交互作用對響應值無顯著性影響。

根據所建立的數學模型,可得出優化后的最佳提取條件:超聲功率450 W,提取時間7 min,液料比10∶1 mL/g,此時,預測植物甾醇提取率為66.58 mg/100 g·dw,經驗證,在上述條件下,使用乙酸乙酯的實際提取率為(57.99±3.37) mg/100 g·dw。

豆類中植物甾醇的含量較高,僅次于谷類;經響應面法優化后的提取方法成本低,時間短,且試劑可回收利用;鷹嘴豆中植物甾醇的提取率于黃豆(111.08 mg/100 g·dw)與黑豆(83.84 mg/100 g·dw),與綠豆接近(64.07 mg/100 g·dw),高于花豇豆(35.61 mg/100 g·dw)、蕓豆(33.01 mg/100 g·dw)等[21]。

2.3 分離純化與種類鑒定

表3 優化實驗回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model for optimization of extraction parameters

表4 植物甾醇混合標準品分析定量參數Table 4 Quantitative parameters of mixed standards

注:y=離子豐度/105。

圖5 各因素交互作用對植物甾醇提取率的影響Fig.5 Effect of interaction of various factors on the yield of phytosterols注:a.超聲功率與提取時間交互作用,液料比為8∶1 mL/g;b.超聲功率與液料比交互作用, 提取時間9 min;c.提取時間與液料比交互作用,超聲功率400 W。

采用體積比為10∶1的石油醚-無水乙醚流動相體系進行洗脫,經檢測,純化后產物的回收率為53.44%。回收率偏低,可能由以下因素造成:硅膠用量偏少;樣品濃度偏大;洗脫劑的種類與比例需進一步調整。本次實驗的主要目的為驗證甾醇提取物的抑菌活性,因此,可在后續實驗中使用柱層析法進一步優化植物甾醇的分離與純化。

按色譜條件進行分析,混合標準品中各植物甾醇化合物在上述條件下能達到很好的分離效果,濃度范圍內標準曲線的相關系數均大于0.998,標準品的分析定量參數如表4所示。

以標準品保留時間與GC-MS中的離子碎片對鷹嘴豆中的主要甾醇進行定性、定量分析,標準品與純化后樣品的總離子流色譜圖結果如圖6所示。可以看出純化后的樣品中主要含有菜油甾醇、豆甾醇與β-谷甾醇,甾醇的定量分析結果如表5所示,β-谷甾醇含量最高,相對含量達到80.43%,菜油甾醇和豆甾醇的相對含量分別為12.48%和7.09%。純化后樣品中的甾醇種類與相對含量與常見豆類比較接近[17]。

表5 純化后樣品中甾醇的相對含量Table 5 Relative amount of phytosterols after purification

表6 鷹嘴豆中植物甾醇提取物的抑菌圈直徑(mm)Table 6 Diameter of zones of inhibition recorded for different microorganisms treated with phytosterols isolated from extract(mm)

注:“-”代表革蘭氏陰性菌,“+”代表革蘭氏陽性菌;“/”代表無抑菌效果;數字為三次平行試驗平均值。

圖6 植物甾醇總離子流色譜圖Fig.6 Total ion current chromatogram of phytosterol注:a.標準品;b.純化后樣品。

2.4 鷹嘴豆中植物甾醇抑菌活性分析

由表6中可知,丙酮作為陰性對照,不具有抑菌活性;青-鏈霉素混合液對四種菌的抑制效果最好;甾醇標準品具有抑菌作用,其效果優于鷹嘴豆中的植物甾醇提取物;甾醇提取物對四種菌都具有一定地抑菌效果,其對于枯草芽孢桿菌的抑菌能力最強,鷹嘴豆中植物甾醇提取物的濃度與抑菌效果之間可能具有量效關系,抑菌效果隨著甾醇濃度的增加而增強。同時甾醇標準品和甾醇提取物的抑菌效果均為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>大腸桿菌。

對于上述試驗中使用的革蘭氏陰性菌,甾醇標準品和甾醇提取物對其抑菌效果相似,但2 mg/mL甾醇提取物對于沙門氏菌的抑菌效果比大腸桿菌好。對于革蘭氏陽性菌,兩者抑制枯草芽孢桿菌效果均強于金黃色葡萄球菌。

3 結論

本次研究的方差分析結果顯示:超聲功率450 W,提取時間7 min,液料比10∶1 mL/g時,鷹嘴豆中植物甾醇具有最大提取率,為(57.99±3.37) mg/100 g·dw。柱層析分離純化植物甾醇的回收率偏低,僅為53.44%。使用GC-MS分析分離純化后的總甾醇,結果發現,鷹嘴豆中甾醇以β-谷甾醇、菜油甾醇與豆甾醇為主,三者比例分別為80.43%、12.48%與7.09%,檢測未發現菜籽甾醇。

本次研究發現,鷹嘴豆植物甾醇提取物對于大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌均有抑制效果。因此,選取鷹嘴豆進行植物甾醇的優化提取是具有一定意義的。本文運用響應面法提取鷹嘴豆中植物甾醇得率較高,且成本低,時間短,可為進一步開發利用鷹嘴豆中植物甾醇提供一定參考。