殼聚糖絮凝法純化牛蒡多糖的工藝優化

許 昕,侯靜宇,王立安

(河北師范大學生命科學學院,河北石家莊 050024)

牛蒡(ArctiumlappaL.)屬菊科兩年生草本植物[1]。據《本草綱目》記載,牛蒡性溫味甘,可“通十二經脈,洗五臟惡氣”,“久服輕身耐老”[2]。牛蒡多糖是由呋喃構型的D-2果糖經β(2→1)糖苷鍵脫水聚合而成的一種果聚糖,末端有葡萄糖殘基,其聚合度一般在2～60[3]。牛蒡根中的多糖含量高達45%[4],而且牛蒡多糖作為一種水溶性膳食纖維,具有清除自由基[5]、增強免疫力[6]、降血脂[7]、改善心血管疾病[8]等功效。

殼聚糖是一類天然的陽離子型高分子絮凝劑[9]。由于分子中含有氨基,殼聚糖在酸性條件下帶有正電荷,因此具有中和電荷與吸附架橋的雙重絮凝作用[10-11],可有效除去多糖中的蛋白質、色素等雜質。它作為甲殼素的脫乙酰化產物,具有良好的生物相容性、無毒性、可降解特性等[12]。近年來,殼聚糖已逐漸運用到猴頭菇[13]、大棗[14]、合歡皮[15]、香菇[16]、翅果油樹葉片[17]等多糖的純化中,并取得良好的效果。

目前,對于牛蒡多糖提取工藝的研究很多[18],如超聲[19]、微波[20]、酶法[21]、超高壓技術[22]等均可得到較熱水浸提更高的多糖提取率。但純化工藝的相關研究較少。按照傳統方法,從多糖提取液中純化多糖需要先經過除小分子雜質、脫色和去蛋白等處理,然后進行乙醇沉析,離心收集濾餅,真空冷凍干燥后制得多糖成品[23]。此傳統工藝步驟繁瑣,雜質均需逐步去除,實驗周期長,生產效率較低而且易造成多糖等有效成分的損失[24]。為了更好地保留有效成分和縮短工藝周期,本文以牛蒡根為材料,采用殼聚糖對牛蒡多糖提取液進行絮凝純化,以多糖保留率、蛋白清除率以及脫色率為評價指標,用正交試驗的方法探討殼聚糖絮凝的最佳工藝,以期為牛蒡多糖的研究開發奠定科學試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牛蒡根 河北省寧晉縣牛蒡生產基地;殼聚糖、BCA蛋白濃度測定試劑盒、1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗壞血酸(VC)、丁基羥基茴香醚(BHA)、過氧化氫 北京索萊寶科技有限公司;干酵母 安琪酵母股份有限公司;95%乙醇、鹽酸、氫氧化鈉 中國醫藥集團化學試劑有限公司;酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限公司;實驗所使用水 均為超純水;其余有機試劑 均為國產分析純。

MULTISKAN GO酶標儀 美國Thermo;FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;MIKRO-22R型臺式冷凍離心機 德國Hettich公司;YH-M10001型電子天平 瑞安市英衡電器有限公司;RE-52AA 51011型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;WKH-7-A型熱風循環烘箱 青州市精誠醫藥裝備制造有限公司;KQ-500E超聲波清洗儀 昆山市超聲波儀器有限公司;FD-1C-50冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖絮凝法制備牛蒡多糖

1.2.1.1 牛蒡多糖提取液的制備 將新鮮牛蒡根于55 ℃下烘干后粉碎,過80目篩,得到牛蒡根干粉。稱取一定量牛蒡粉,按照1∶10 (g/mL)的料液比于70 ℃浸提90 min,3500 r/min離心15 min,取濾渣,按照相同步驟再浸提一次,合并前兩次的提取液得到牛蒡多糖提取液[23]。

1.2.1.2 殼聚糖絮凝 精確稱取10.0000 g殼聚糖加入1%(v/v)乙酸溶液溶解并定容至1000 mL,充分攪拌均勻,于4 ℃條件靜置6 h后使用。取1.2.1.1中的40 mL牛蒡多糖提取液(pH5.4),加入4 mL殼聚糖醋酸溶液,混勻后在一定溫度下靜置一定時間后,12000 r/min離心15 min后,取少量上清液檢測蛋白質、多糖、色素含量的變化。

1.2.1.3 牛蒡多糖制備 將在特定條件下絮凝純化后的多糖上清液減壓濃縮、真空冷凍干燥,得到牛蒡多糖粉末,稱重備用。

1.2.2 殼聚糖絮凝法純化牛蒡多糖單因素實驗

1.2.2.1 殼聚糖用量對絮凝純化效果的影響 在26 ℃條件下,固定絮凝時間為45 min,向多糖提取液中分別加入不同用量殼聚糖溶液(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL/g,殼聚糖用量定義為:1%殼聚糖醋酸溶液體積/生藥材質量),考察殼聚糖用量對絮凝純化效果的影響(換算后1%殼聚糖醋酸溶液量不足4 mL的用超純水補足)。

1.2.2.2 殼聚糖絮凝時間對牛蒡多糖純化效果的影響 在26 ℃條件下,固定殼聚糖用量為1.2 mL/g,通過改變絮凝時間(15、45、75、105、135 min),考察絮凝時間對于牛蒡多糖純化效果的影響。

1.2.2.3 提取液pH對牛蒡多糖絮凝純化效果的影響 調節多糖提取液pH,在26 ℃條件下,固定殼聚糖用量為1.2 mL/g,絮凝時間45 min,考察多糖提取液不同pH(2、3、4、5、6、7)對絮凝效果的影響。

1.2.2.4 絮凝溫度對絮凝純化效果的影響 固定殼聚糖用量為1.2 mL/g,絮凝時間45 min,多糖提取液pH為4,考察不同溫度(26、30、40、50、60、70 ℃)對牛蒡多糖提取液絮凝效果的影響。

1.2.3 正交試驗 考慮到在26 ℃條件下絮凝效果最佳,后續試驗在室溫(26 ℃)條件下進行。選取提取液pH、絮凝時間和殼聚糖用量為考察因素,以多糖保留率、蛋白清除率、脫色率為評價指標,采用L9(34)正交試驗表(表1)進行正交試驗,從而得出殼聚糖絮凝的最佳工藝條件。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 L9(34)orthogonal experimental design and factors

1.2.4 傳統水提醇沉工藝制備牛蒡多糖方法 多糖提取液的制備方法同1.2.1.1,將所得牛蒡多糖提取液60 ℃真空濃縮至原體積的1/3,采用Sevag法去蛋白,即將氯仿與正丁醇以4∶1 (v/v)混合加入4倍體積多糖提取液中,充分振蕩10 min后4000 r/min離心10 min,重復去蛋白3次之后,取上層液體加入4倍體積的95%乙醇,邊加邊快速攪拌,于4 ℃條件下靜置10 h后,3500 r/min離心15 min,以無水乙醇洗滌沉淀,后真空冷凍干燥,即可得到牛蒡多糖[25-27]。將其用超純水配制成0.1 mg/mL的多糖溶液,測定多糖含量,計算得率以及純度,并與正交試驗得出的最佳絮凝工藝條件下制得牛蒡多糖的各項指標比較。

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 多糖標準曲線的繪制及多糖含量的測定 參照馬寧等[28]的方法并稍作修改。精密稱取10.0 mg葡萄糖,加入適量超純水溶解,并定容至100 mL,搖勻即得0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液。分別精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的標準葡萄糖溶液,并用水補至1 mL,然后依次加入1.6 mL 5%苯酚溶液和7 mL濃硫酸,迅速搖勻,30 min后于490 nm處測定吸光度。以質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪得葡萄糖標準曲線,得回歸方程Y=a1X+b1。將牛蒡多糖樣品用超純水稀釋1000倍后,依照上述方法,測定其490 nm處的吸光度值,結合以下公式測得多糖含量。

式中,F表示多糖含量,μg;A490為490 nm處吸光度;a1、b1均為葡萄糖標準曲線中的系數值;N為稀釋倍數;V為樣品溶液的定容體積,mL。

1.2.5.2 蛋白標準曲線的繪制及蛋白含量的測定 參照李海玲等[29]的方法,按BCA試劑A∶B=50∶1的比例配制工作液,將0.5 mg/mL的標準BSA溶液按照0、1、2、4、8、12、16 μL加入96孔板,并用PBS溶液補至20 μL。然后每孔加入200 μL工作液,37 ℃孵育30 min后于562 nm處檢測吸光度。以蛋白質質量濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪得蛋白標準曲線,得回歸方程Y=a2X+b2。將牛蒡多糖樣品稀釋10倍,依照1.2.2的方法,測定562 nm處的吸光度值,并由蛋白標準曲線方程求得蛋白質含量:

式中,P表示蛋白含量,μg;A562為562 nm處吸光度,a2、b2均為蛋白質標準曲線中的系數值;N為稀釋倍數;V為樣品溶液的定容體積,mL。

1.2.5.3 多糖保留率、蛋白清除率、脫色率的測定 在按照1.2.5.1和1.2.5.2的方法求得多糖含量、蛋白含量后,按照以下公式計算即可得到多糖保留率、蛋白清除率。

式中,F1表示絮凝純化前多糖含量,μg;F2表示絮凝純化后多糖含量,μg。

式中,P1表示絮凝純化前蛋白含量,μg;P2表示絮凝純化后蛋白含量,μg。

取絮凝后上清液直接檢測420 nm處吸光度值,作為色素含量檢測方法。脫色率計算公式如下:

式中,A1表示多糖提取液絮凝純化之前的420 nm處吸光度值,A2表示多糖提取液絮凝純化之后的420 nm處吸光度值。

1.2.5.4 多糖得率和純度的測定

式中:m2表示在最佳的絮凝條件下按照1.2.1.3步驟純化的多糖樣品質量,g;m1表示原料質量,g。

納什在《旅游作為人類學的一個主題》中指出：在人類社會中，旅游是普遍存在的一種人類活動，而旅游包含著不同文化、亞文化之間的接觸［3］。

將按照1.2.1.3中制備的多糖粉末配制成濃度為100 μg/mL的多糖溶液,取1 mL的多糖溶液用1.2.5.1的方法進行檢測,得到吸光度值,多糖純度計算公式如下:

式中,A490表示490 nm處的吸光度;a1、b1均為葡萄糖標準曲線中的系數值。

1.2.6 多糖的抗氧化活性檢測

1.2.6.1 DPPH·清除能力檢測 參考Sharma等[30]的方法,并做若干修改。用無水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH·溶液,并將之與不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL)的樣品溶液分別混合,37 ℃暗反應30 min,在517 nm處測定吸光度值。同時,采用維生素C作為陽性對照。以下為DPPH·清除率計算方法:

式中,A0為100 μL DPPH·溶液+100 μL水的517 nm處的吸光度值;A1是100 μL DPPH·溶液+100 μL樣品的517 nm處的吸光度值;A2是100 μL樣品+100 μL無水乙醇的517 nm處的吸光度值。

1.2.6.2 酵母細胞保護試驗 實驗參照并優化了Joshi等[31]的研究方法,實驗操作步驟如下:將培養到對數期的酵母細胞經離心后混懸于100 mmol/L(pH=7.4)的磷酸鹽緩沖液中,并調整細胞濃度至1×107～2×107個/mL[32]。取不同濃度(5、10、15、20、25、30 mg/mL)的多糖樣品溶液加入酵母細胞懸浮液中,于37 ℃溫浴2 h后,再加入一定量H2O2溫浴1 h。經過上述處理的反應體系稀釋適當倍數后,采用YEPD平板進行活菌計數[33],BHA做陽性對照,抗氧化劑對酵母細胞的保護作用按照以下的公式進行計算:

式中:Ai為3 mL細胞懸液+1 mL樣品溶液+2.1 mL 0.14% H2O2溶液的平板活菌計數;Aj為3 mL細胞懸液+3.1 mL蒸餾水的平板活菌計數;Ao為3 mL細胞懸液+1 mL蒸餾水+2.1 mL 0.14% H2O2溶液的平板活菌計數。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 多糖和蛋白質標準曲線

2.1.1 葡萄糖標準曲線 以葡萄糖質量濃度(μg/mL)為橫坐標,490 nm處的吸光度值為縱坐標,進行線性回歸,得到回歸方程Y=0.00368X-0.00464(R2=0.9989),線性范圍為10～60 μg/mL,標準曲線見圖1。

2.1.2 蛋白質標準曲線 以蛋白質質量濃度(μg/mL)為橫坐標,562 nm處的吸光度值為縱坐標,進行線性回歸,得到回歸方程Y=0.00315X+0.0402(R2=0.9884),說明25～400 μg/mL范圍內線性關系良好,本研究中所有蛋白測定均使用該標準曲線。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Calibration curve for glucose determination

圖2 蛋白質標準曲線Fig.2 Calibration curve for protein determination

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 殼聚糖用量對牛蒡多糖純化效果 如圖3所示,隨著殼聚糖用量的增加,牛蒡多糖提取液的脫色率和蛋白清除率不斷升高,當殼聚糖用量達1.2 mL/g以后,二者增幅變緩。另外,隨著殼聚糖用量的增加,牛蒡多糖保留率呈逐步下降趨勢。這可能是由于殼聚糖作為一種吸附劑,在絮凝色素和蛋白質的同時,也會對與蛋白質緊密結合的多糖起到一定的吸附沉降作用[34]。綜合考慮上述因素,選擇殼聚糖濃度為1.2 mL/g為適宜殼聚糖用量。

圖3 殼聚糖用量對牛蒡多糖保留率、 蛋白清除率和脫色率的影響Fig.3 Effects of chitosan dosages on polysaccharide retention rate,protein removal rate and decolorization rate

2.2.2 絮凝時間對牛蒡多糖純化效果的影響 如圖4所示,在15～45 min階段,蛋白質清除率逐漸增長,在45 min后,蛋白質的去除率增勢趨緩。脫色率同樣在絮凝開始階段上升,而在45 min后基本不變。另外,多糖保留率在15～135 min范圍內略有下降但不明顯(圖4)。這可能是因為隨著絮凝時間的延長,蛋白質和色素已與殼聚糖充分接觸并結合為絮團,即殼聚糖對蛋白膠粒吸附飽和[35],綜合考慮選擇45 min為適宜絮凝時間。

圖4 殼聚糖絮凝時間對多糖保留率、 蛋白清除率和脫色率的影響Fig.4 Effects of treating time of chitosan on polysaccharide retention rate,protein removal rate and decolorization rate

2.2.3 提取液pH對牛蒡多糖純化效果的影響 實驗結果表明(圖5),在提取液pH從2升至4的過程中,殼聚糖蛋白質清除率逐漸增大,此后逐漸變小。這可能是由于殼聚糖在偏酸性的溶液中,分子上的氨基被質子化,使得殼聚糖帶有正電荷,較易與牛蒡多糖提取液中呈陰離子型的雜質結合[36]。從圖5還可看出,在pH在2～7之間,多糖保留率和脫色率有微小波動,但整體變化不大。綜合考慮選取提取液pH4為適宜pH。

圖5 pH對多糖保留率、蛋白清除率和脫色率的影響Fig.5 Effect of pH on polysaccharide retention rate, protein removal rate and decolorization rate

2.2.4 絮凝溫度對牛蒡多糖純化效果的影響 實驗結果表明(圖6),隨著絮凝溫度的升高,多糖保留率和脫色率基本不變,而蛋白質清除率均逐漸下降,這可能是溫度升高使得分子熱運動加快,絮凝劑分子老化,架橋長度變短,不利于形成大的絮團[34]。所以,絮凝純化溫度在室溫26 ℃即可。

表2 殼聚糖絮凝實驗結果與分析Table 2 Result and analysis of chitosan-based flocculation of polysaccharides

注:R表示因素的極差。

圖6 溫度對多糖保留率、蛋白清除率和脫色率的影響Fig.6 Effects of temperature on polysaccharide retention rate,protein removal rate and decolorization rate

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果及極差分析見表2,多糖保留率、蛋白質清除率和脫色率方差分析分別見表3。從表2及表3可知,若以多糖保留率作為評價指標,通過極差分析可知,各因素的影響效果A>C>B,即提取液pH>殼聚糖用量>絮凝時間,最佳工藝條件為A1B1C3。另外,方差分析結果(表3)顯示,A、B、C因素對多糖保留率均無顯著影響。

若以蛋白清除率作為評價指標,通過極差分析可知,各因素的影響效果B>C>A,即絮凝時間>殼聚糖用量>提取液pH,最佳工藝條件為A2B1C3。另外,方差分析結果顯示,A因素對蛋白清除率的影響達顯著水平,B、C因素對蛋白清除率的影響達到極顯著水平。

若以脫色率作為評價指標,通過極差分析可知,各因素的影響效果C>B>A,即殼聚糖用量>絮凝時間>提取液pH,最佳工藝條件為A2B1C3。另外,方差分析結果顯示,A、B、C因素對脫色率均無顯著影響。

綜合以上三個考察因素,最終確定牛蒡多糖殼聚糖絮凝法最佳條件為A2B1C3,即提取液pH為4,絮凝時間15 min,殼聚糖用量1.2 mL/g,、此時,多糖保留率為87.15%±0.24%,蛋白清除率為54.15%±0.48%,脫色率為79.43%±0.31%。

表3 絮凝實驗方差分析表Table 3 Variance analysis of flocculation experiment

2.4 絮凝法和傳統水提醇沉法的比較

2.4.1 純化工藝的比較 由表4可以看出,絮凝法耗時少,生產周期短,而且在最佳絮凝條件下,多糖得率和純度分別比傳統水提醇沉工藝提高了33%,15%,因此殼聚糖絮凝法是一種較好的純化牛蒡多糖的方法。

表4 絮凝法和水提醇沉法的比較Table 4 Comparison of chitosan-and ethanol-based purification of polysaccharides

圖7 兩種方法制備牛蒡多糖的DPPH·清除率Fig.7 Results of DPPH· scavenging capacity of polysaccharide prepared by two methods

2.4.2 DPPH·清除活性的比較 殼聚糖絮凝法和醇沉法制備多糖樣品的DPPH·清除能力如圖7所示,DPPH·清除率和樣品濃度之間存在明顯的量效關系,且殼聚糖絮凝法制得的牛蒡多糖比水提醇沉制備的多糖DPPH·清除能力強。當殼聚糖絮凝法制備的多糖樣品濃度達1.2 mg/mL時,DPPH自由基清除率已達77.61%。

2.4.3 對氧化應激酵母細胞保護作用的比較 如圖8所示,隨著樣品濃度的增加,其對酵母細胞的保護率呈升高趨勢,說明兩種多糖樣品均對H2O2氧化損傷的酵母細胞有劑量依賴性。當樣品濃度為30 mg/mL,絮凝法制得的多糖對氧化損傷酵母細胞的保護率為40.04%±1.60%,傳統水提醇沉制得的多糖樣品對氧化損傷的酵母細胞的保護率為33.83%±0.81%,說明絮凝法制得的牛蒡多糖的抗氧化活性優于水提醇沉法多糖。

圖8 兩種方法制備牛蒡多糖 對氧化損傷酵母細胞的保護作用Fig.8 Protective effects of polysaccharide prepared by two methods on oxidative damaged yeast

3 討論與結論

本文通過正交試驗得到殼聚糖絮凝法純化制備牛蒡多糖的工藝條件:殼聚糖用量為1.2 mL/g,絮凝時間為15 min,提取液pH為4。在此條件下,多糖得率和純度均在傳統水提醇沉工藝的基礎上有一定提高,并證實絮凝法制備牛蒡多糖不僅用時短,而且抗氧化活性更強,為進一步開發利用牛蒡多糖提供了新方法。但絮凝法制備的牛蒡多糖仍為粗多糖,若后期需要繼續提高多糖純度或進一步對多糖進行分級純化[37],則可結合超濾[38]等方法進行。

本文為比較兩種多糖的抗氧化活性采用了兩種方法。其中DPPH自由基清除能力檢測是體外抗氧化實驗中最經典的,也是使用最廣泛的方法[39]。而選取酵母細胞對多糖的抗氧化活性進一步檢測是因為酵母細胞和人有很多的同源基因,所以二者的抗氧化機制可能有相似之處[40],酵母細胞可以較好地模擬人體細胞受到氧化應激的狀態。兩種方法均顯示,殼聚糖法制得的牛蒡多糖均具較好的抗氧化活性,為制備牛蒡多糖產品的功能定位指明了方向。

另外,殼聚糖作為一種有抗菌、抗氧化[41]等作用的食品添加劑,即使少量殘留在多糖產品中也不會影響其品質。而且,殼聚糖來源于蝦蟹外殼等水產廢料,是世界上產量僅次于纖維素的第二大天然可再生資源[42]。采用殼聚糖作為絮凝劑是對生物資源的合理利用,充分體現了資源節約、環境友好的發展理念。

綜上,本研究結果為牛蒡的精深加工提供了科學依據。