基于表面增強拉曼光譜的養殖水中硝基呋喃類抗生素殘留檢測

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(1.上海市食品藥品檢驗所,上海 201203; 2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海 201206)

硝基呋喃類藥物(Nitrofurans)是一類人工合成的具有5-硝基呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物,常用的有呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)、呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ)、呋喃妥因(Nitrofurantion,NFT)和呋喃它酮(Furaltadone,FTD)等,4種呋喃類抗生素分子結構式如圖1所示。硝基呋喃類作為廣譜性抗菌藥曾廣泛應用于畜禽和水產養殖業中,用于治療因革蘭氏陰性菌、真菌和一些原蟲引起的疾病[1]。但由于該類藥物及其代謝物具有顯著的致畸、致癌、致突變等毒性作用,歐盟、美國、日本等多個國家都明令禁止其在水產養殖中的應用[2-4],我國農業部也于2002年在第193號公告中規定禁止在食用動物上使用硝基呋喃類藥物[5]。但因硝基呋喃類藥物的價格低廉且藥效顯著,在水產養殖中仍常有違法使用的情況,水產養殖動物中硝基呋喃類藥物殘留仍不容樂觀。根據近年來的風險隱患排查結果,硝基呋喃仍是檢出率最高的違禁藥物之一[6]。

圖1 四種硝基呋喃類抗生素的分子結構式Fig.1 Molecular structures of four nitrofuran antibiotics

因硝基呋喃類藥物半衰期很短,在動物體內能迅速代謝,目前硝基呋喃類藥物的殘留檢測對象主要集中于其代謝物的檢測,分析手段包括高效液相色譜法[7-8]、液相色譜-質譜聯用法[9-10]、免疫分析法[10-12]等。其中,高效液相色譜法和液相色譜-質譜聯用法樣品前處理過程復雜、分析周期長、有機溶劑消耗量大,且對操作者專業能力要求較高,不便于基層推廣使用。酶聯免疫法易受外界環境干擾,易發生交叉反應,假陽性率較高。在水產養殖過程中硝基呋喃類藥物往往是直接投喂使用,造成其可能未經過生物體代謝而直接在池塘的底泥沉積物中不斷蓄積,隨著外界環境的變化進一步向水體中緩慢釋放,產生二次污染,由此導致的質量安全問題亟待解決[4,13-14]。目前針對養殖環境中的生產養殖及流通過程中硝基呋喃類抗生素殘留測定的方法相對較少,有必要建立準確、可靠、快速的檢測方法,從源頭上對水產品生產養殖和流通環節進行安全監控。

表面增強拉曼光譜技術克服了傳統拉曼光譜靈敏度低的缺點,能夠實現痕量物質的檢測,同時還具有無需樣品前處理(或前處理簡單)、檢測速度快、易實現現場檢測等優點[15]。因此,目前已廣泛應用于食品快檢、環境監測、生物醫學等領域,在食品中農獸藥殘留、限用或禁用添加劑中已展現出良好的應用前景[16-18]。

結合便攜式拉曼光譜儀,本研究擬建立一種利用表面增強拉曼光譜快速檢測養殖水中硝基呋喃類藥物殘留量的方法,為生產、流通環節中硝基呋喃類藥物殘留的現場、快速檢測探索新的途徑和方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

空白試樣的選擇 選取魚養殖用水作為空白試樣,購自上海本地菜場,按確證方法SZDB/Z 323-2018 《水產品養殖水中21種磺胺類、氯霉素類、四環素類、硝基呋喃類、喹諾酮類和孔雀石綠的測定高效液相色譜-串聯質譜法》進行檢測,經測試不含硝基呋喃類抗生素;呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮 Dr. Ehrenstorfer公司,純度均大于98.0%;呋喃西林 中國食品藥品檢定研究院,純度99.40%;硝酸銀、檸檬酸三鈉 美國Sigma公司,純度均大于99.0%;氯金酸 J&K Scientific公司,純度99.99%;甲醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈 色譜純,德國Merck公司;氯化鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;0.45 μm水相濾膜 天津津滕公司;實驗室用水為Milli-Q超純水;所用玻璃儀器均用王水徹底浸泡,并用超純水反復清洗。

Food Defender RM便攜式拉曼光譜儀、SORVALL ST40R高速離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司;VORTEX 4 digital渦旋儀 德國IKA公司;Organomation MULTIVAP氮吹儀 美國Organomation Associates公司;Sartorius BS 2202S/CP225D天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑的制備 按照文獻所述方法制備金溶膠[19]和銀溶膠[20]。 金溶膠的制備:精確稱量0.0787 g氯金酸于1 L容量瓶中配制2×10-4mol/L的氯金酸水溶液,取50 mL 2×10-4mol/L的氯金酸水溶液于三口燒瓶中,在油浴鍋內加熱至沸,磁力攪拌下迅速加入0.74 mL質量濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液,繼續加熱5 min后停止,然后將金溶膠放入水中冷卻至室溫,再置于冰箱內4 ℃避光保存。

銀溶膠的制備:稱取45 mg硝酸銀于圓底燒瓶中,加入250 mL超純水溶解,安裝好冷凝回流裝置,加熱至沸,逐滴加入5 mL質量濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液,繼續加熱1 h后停止。冷卻至室溫后于4 ℃冰箱內避光保存。

1.2.2 標準溶液配制 硝基呋喃類抗生素儲備溶液(0.5 mg/mL):分別準確稱取呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮和呋喃它酮標準品各25 mg,分別置于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。

硝基呋喃類抗生素工作溶液(10 μg/mL):分別精密量取呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮和呋喃它酮標準儲備溶液各200 μL,分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。

1.2.3 樣品檢測方法 取養殖水適量,用0.45 μm水相濾膜過濾,待測。各硝基呋喃類抗生素SERS拉曼檢測方法具體方法如下:

呋喃妥因:取200 μL養殖水,加入20 μL 0.1 mol/L MgCl2溶液及20 μL 0.01 mol/L KOH溶液,混勻,加入20 μL銀溶膠,充分混勻,1 min后檢測分析。

呋喃西林:取200 μL養殖水,加入20 μL 0.1 mol/L MgCl2溶液及20 μL 0.01 mol/L KOH溶液,混勻,加入20 μL金溶膠,充分混勻,1 min后檢測分析。

呋喃它酮:取200 μL養殖水,加入20 μL 0.1 mol/L MgCl2溶液混勻,加入20 μL金溶膠,充分混勻,1 min后檢測分析。

呋喃唑酮:取200 μL養殖水,加入20 μL 0.1 mol/L MgSO4溶液及20 μL 0.01 mol/L KOH溶液,混勻,加入50 μL金溶膠,充分混勻,1 min后檢測分析。

1.2.4 拉曼光譜測定 激發光源波長785 nm,激光光源功率250 mW,光譜采集范圍250～2875 cm-1。每個樣品重復3次,并將采集的光譜計算平均值用于數據分析。

1.3 數據處理

文中圖表處理主要采用Origin 8.0與Microsoft Excel軟件。

2 結果與分析

2.1 四種硝基呋喃類抗生素特征峰歸屬

呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮和呋喃它酮的的SERS譜圖如圖2所示。硝基呋喃類抗生素的主要組成部分即呋喃環、NO2、C-C=N的拉曼頻率主要集中在800～1620 cm-1,以呋喃唑酮為例,其主要特征峰在圖譜中清晰可見,具體歸屬如下:801 cm-1處H-C-C-H的面外彎曲振動;1022 cm-1處H-C-H的面內彎曲振動、NO2的伸縮振動;1186 cm-1處的C-O伸縮振動;1333 cm-1處的H-C-H對稱伸縮振動、呋喃環搖擺振動;1470 cm-1處的呋喃環面內對稱伸縮振動;1578 cm-1處的NO2非對稱伸縮振動及呋喃環的對稱伸縮振動;1602 cm-1處的C=N面內對稱伸縮振動。在這四種硝基呋喃類物質中,這些主要振動都有所體現,但有一定的位移。

圖2 四種硝基呋喃類抗生素的拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectra of four nitrofuran antibiotics

這些共同的主要振動在四種物質之間也體現出一定的差異。在峰強方面,呋喃妥因1609 cm-1處的特征峰歸屬于C=N面內對稱伸縮振動,其峰強明顯大于其它三個化合物;對應于呋喃環伸縮振動的特征峰中,1333 cm-1的譜峰是這四類化合物中最強特征峰,但呋喃它酮中位于1466 cm-1的譜峰峰強比其它三個化合物較為強烈;呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因分別在1171 cm-1、1170cm-1、1174 cm-1處有不同層度的C-N-N振動,但在呋喃唑酮拉曼光譜圖中未有體現。

2.2 拉曼檢測條件的優化

2.2.1 促凝劑的優化 為檢測養殖水中微量的硝基呋喃類化合物,需要使用SERS增強試劑對其信號放大,同時也需要加入具有促凝作用的納米溶膠的促凝劑。本實驗分別使用氯化鈉、碳酸鈉、氯化鉀、溴化鉀、碘化鉀、碳酸鉀、硫酸鎂、氯化鎂試劑作為促凝劑,檢測了濃度為10 μg/mL的四種硝基呋喃類抗生素水溶液的SERS光譜圖。檢測時溶液中選用的促凝劑的濃度均為0.1 mol/L,添加體積為20 μL,在促凝劑加入1 min后采集SERS光譜以保證溶膠的促凝達到穩定狀態。4種硝基呋喃類抗生素促凝劑優化的拉曼光譜圖如圖3所示。從圖3中可以看到,以氯化鎂作為溶膠促凝劑,呋喃妥因、呋喃西林、呋喃它酮的拉曼光譜可觀測到非常明顯的拉曼特征峰,而呋喃唑酮選用硫酸鎂具有更好的SERS增強效果。

2.2.2 納米增強試劑的優化 本實驗比較了金納米溶膠及銀納米溶膠對四種硝基呋喃類抗生素的增強效果,圖譜如圖4。金納米溶膠與水結合,干擾小,基本不出現拉曼峰,可排除空白溶劑峰的干擾。金納米對四種硝基呋喃類抗生素的都具有增強效果,拉曼信號都較強,且主要的拉曼特征峰都得到了增強。銀納米溶膠對呋喃它酮的增強效果不如金納米溶膠明顯,對呋喃西林和呋喃唑酮也只有在1020和1470 cm-1左右出現兩個峰,而對呋喃妥因具有明顯的增強效果。綜上所述,考慮干擾大小、增強效果與峰形規則性等因素,金納米溶膠是檢測呋喃西林、呋喃唑酮和呋喃它酮比較理想的納米增強試劑,銀納米溶膠更適合檢測呋喃妥因。

2.2.3 pH的影響 通過控制納米顆粒的pH,能增加分析物與金屬表面有效接觸,從而增強拉曼信號,因此本實驗使用 0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L KOH溶液在pH2、3、5、7范圍內調節納米溶膠的pH,用以考查pH對于SERS信號的影響。實驗發現原始制備的金膠(pH=3)對呋喃它酮的SERS檢測效果最佳,當加入適量0.1 mol/L KOH溶液調節pH時(pH=5),呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮SERS檢測效果最佳。以呋喃妥因為例,結果如圖5所示,呋喃妥因當加入少量0.1 mol/L KOH溶液(pH=5)時,金屬納米粒子會發生一定程度的團聚,有利于“熱點”的產生,從而使得增強效果增加。當加入過多酸pH降低時,納米粒子會過度團聚,降低增強效果;當加入過量堿pH太高時,由于H+較少,沒有將表面的負離子完全中和,靜電荷的“同性相斥”原理使得金屬粒子間的距離太遠,也會造成增強效果不佳。這是由于調整體系的pH可以改變納米粒子表面的電荷,從而改變其聚集程度,調控納米粒子間距從而形成耦合效應,并對拉曼信號的增強起到促進作用[21]。因此,pH=5時呋喃妥因標準溶液的SERS檢測效果最佳。

圖3 四種硝基呋喃類抗生素促凝劑優化拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectra of four kind nitrofuran antibiotics in different solvents

圖4 四種硝基呋喃類抗生素納米增強試劑優化拉曼光譜圖Fig.4 Raman spectra of four nitrofuran antibiotics in different colloidal nanoparticles

圖5 pH對SERS強度的影響Fig.5 Effect of pH level on SERS intensity

2.2.4 納米溶膠體積 納米溶膠是一種液態SERS基底,在使用時可以與待測樣品溶液以任意比例混合。不同的混合比例導致最終體系的納米顆粒的濃度和待測樣品的濃度都不相同。當納米粒子用量的增加時,物質與納米粒子結合更充分,拉曼響應信號有一定程度的增強,但當納米粒子用量增加到一定程度時,可能會對物質形成比較厚的包裹層,降低物質拉曼信號的檢測[22]。因此,選擇合適的比例有利于物質的檢測,實驗中選用20 μL 0.1 mol/L促凝劑溶液,研究了加入不同體積納米溶膠對硝基呋喃檢測效果的影響,且選用峰強較強、峰形較好且附近基線平滑的光譜峰作為特征峰,呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮分別選取了1337、1185、1239、1342 cm-1處作為特征峰。如圖6所示,逐漸增加納米溶膠體積后,特征峰的強度呈現先增后減的趨勢。當呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮納米溶膠體積分別為20、50、20、20 μL,增強效果最明顯。

2.2.5 吸附等待時間 研究發現,待測物質與納米增強試劑的結合時間對 SERS 增強效果具有一定的影響。將一定比例的納米溶膠與呋喃妥因抗生素溶液混合進行SERS檢測。如圖7所示,隨著等待時間的延長,拉曼效應有所增強。在等待時間為1 min時,SERS效果可達到最佳。在第5 min時,SERS效果開始明顯減弱。因此,當納米溶膠與呋喃類抗生素混合1 min時進行SERS檢測的效果最佳。

圖6 不同體積納米溶膠對四種硝基呋喃類抗生素拉曼光譜強度的影響Fig.6 Effects of different volumesof nanosols on Raman spectral intensity of four nitroturan antibiotics colloidal nanoparticles solution

圖7 納米溶膠在放置不同時間后 對呋喃妥因增強效果對比圖Fig.7 Comparison of SERS spectra of nitrofurantion in colloidal nanoparticles in different time

2.3 方法學考察

依據食藥監科便函[2016]83號《食品快速檢測方法評價技術規范》的要求,對建立的4種硝基呋喃類抗生素SERS增強拉曼快檢方法進行方法學考查,評價指標包括:檢出限、假陰性率和假陽性率、特異性、交叉反應、與現有方法一致性分析,各評價指標具體內容如下,方法學評價詳細計算結果詳見表1。

2.3.1 檢測限 取空白養殖用水若干份,分別添加質量濃度為0、1、2 μg/mL呋喃妥因、0、0.1、0.2 μg/mL呋喃西林、0、5、10 μg/mL呋喃唑酮、0、0.1、0.2 μg/mL呋喃它酮標準品至空白樣本中,按照分析步驟進行測定,每個濃度重復測定3次,觀察檢測結果,當呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮添加濃度分別為1、0.1、5、0.1 μg/mL時,拉曼檢測結果均為陽性,最終確定呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮的檢測限分別為1、0.1、5及0.1 μg/mL。

2.3.2 假陰性率和假陽性率 取空白養殖水若干,分別添加4種硝基呋喃標準溶液,分別制成添加水平為0、最低檢出限、2倍最低檢出限的樣品各一式 20 份,按各硝基呋喃類抗生素前處理方法和分析步驟進行結果測定。4種硝基呋喃抗生素的檢測結果顯示,呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮中20份空白樣本的檢測結果為陰性的分別為20、20、20和19個,相應的有0、0、0和1個為陽性,假陽性率分別為0%、0%、0%和5%;呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮中40份陽性添加濃度樣本的檢測結果為陽性的分別為38、40、38和40個,相應的有2、0、2和0個為陰性,假陰性率分別為5%、0%、5%和0%。

表1 4種硝基呋喃類抗生素方法學評價結果Table 1 Results of methodological evaluation of SERS methods of four nitrofuran antibiotics

2.3.3 特異性分析 特異性是考查在實驗條件下達到的實際最低檢出限水平時,檢出陰性結果的陰性樣品數占總陰性樣品數的百分比。呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮的特異性分別為100%、100%、100%和95%,符合食藥監科便函[2016]83號《食品快速檢測方法評價技術規范》要求。

2.3.4 交叉反應 分別以濃度為50 μg/kg的呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮混合標準溶液考察4種呋喃類抗生素交叉反應情況時,發現在呋喃西林、呋喃它酮和呋喃唑酮均存在交叉反應,呋喃妥因使用的納米銀溶膠,與其他3種呋喃類抗生素均不存在交叉反應。

2.3.5 與現有方法一致性分析 將本研究方法與基準方法SZDB/Z 323-2018 《水產品養殖水中21種磺胺類、氯霉素類、四環素類、硝基呋喃類、喹諾酮類和孔雀石綠的測定高效液相色譜-串聯質譜法》檢測所得到的陽性結果比率相比較,這兩種方法在5%置信區間內不存在統計學差異(χ2=<3.84);同時方法的靈敏度、特異性≥95%、假陰性率和假陽性率≤5%,均符合食藥監科便函[2016]83號《食品快速檢測方法評價技術規范》的要求。

2.4 實際樣品測定

為驗證方法可行性,收集各品種水產品養殖水,包括蝦類、魚類、貝類等樣品基質養殖用水共60批樣品,分別按照SERS拉曼法與確證方法SZDB/Z 323-2018 《水產品養殖水中21種磺胺類、氯霉素類、四環素類、硝基呋喃類、喹諾酮類和孔雀石綠的測定高效液相色譜-串聯質譜法》進行檢測,測定結果一致。

3 結論

本文基于SERS技術建立了養殖水樣中4種硝基呋喃類抗生素的快速檢測方法。養殖水中4種硝基呋喃類抗生素呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮的檢測限分別為1、0.1、5、0.1 μg/mL。所建立的快檢方法靈敏度、特異性≥95%、假陰性率和假陽性率≤5%,結果均符合食品快速檢測方法評價技術規范。本方法可用于定性分析養殖水中硝基呋喃類抗生素,不需復雜的前處理,單個樣品檢測時間在3 min內,為養殖水中硝基呋喃類抗生素的檢測提供了確實可行的方法。