人參皂苷Rh1對AD小鼠認知障礙的改善作用

畢云楓,陶偉明,王溪竹,李彤昕,閆 璐,孫 航,鄭明珠,劉景圣

(吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s Disease,AD)又稱老年癡呆,屬于退行性疾病的一種,此病以認知功能障礙和記憶力減退為主要特征,是目前死亡率最高的四大疾病之一,預計到2050年,全世界85人中將有1人患有此病[1-3]。阿爾茨海默癥早期階段的表現為輕度認知障礙(mild cognitive impairment,MCI)[4-5],該病起病隱匿,病程較長[6],且MCI轉為AD的危險性比正常人群高10倍,若能盡早發現并干預,可以減輕患者癥狀,延緩病情發展[7]。認知功能下降主要與膽堿能神經傳遞完整性降低有關。由于東莨菪堿誘導的遺忘癥是由膽堿能信號傳導阻滯引起的,因此它被用于模擬AD相關的認知缺陷[8-9]。乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach)是一種神經遞質,屬于中樞膽堿能系統,在記憶調節中起著重要作用[10]。東莨菪堿是毒蕈堿拮抗劑,誘導中樞膽堿能阻滯,并可在記憶維持中產生可逆損傷可用于AD建模[11]。

人參指五加科植物人參的干燥根和根莖,在世界范圍內用于預防各種疾病,包括抗疲勞、抗壓力、免疫調節、抗癌癥等[12-13]。商崇智等[14]發現Rg2能改善東莨菪堿誘導的AD小鼠的記憶;Gong等[15]研究人參皂苷Rg2能顯著改善血管性癡呆大鼠的學習記憶障礙;張敏等[16]報道了人參皂苷Rg2可以減輕大鼠海馬神經元的損傷,從而提高學習記憶能力。人參皂苷Re、Rg1、Rg2是主要的三醇組天然皂苷,但是隨著人參皂苷生物降解技術的發展,人參皂苷Re、Rg1、Rg2均可被降解為人參皂苷Rh1[17-18]。人參皂苷Rh1在C-6鍵上比Rg2少一個鼠李糖糖苷鍵,其結構如圖1所示[19]。已有研究證實,人參皂苷Rh1具有抗癌、抗腫瘤、治療皮膚疾病、提高免疫力等功效[20-23]。Wang等[24]發現Rh1對行為測試和電生理學研究中的記憶障礙和海馬興奮性均有改善作用,但國內外對人參皂苷Rh1改善認知障礙的研究尚少。

圖1 人參皂苷Rh1結構圖Fig.1 Structure diagram of ginsenoside Rh1

因此,本文向雄性昆明小鼠腹腔注射東莨菪堿建立AD模型,以石杉堿甲作為陽性對照組,研究人參皂苷Rh1對模型小鼠輕度認知障礙的改善作用,為其開發成為延緩AD藥物作參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明小鼠 40只,雄性,6周齡,22～30 g,合格證編號:SCXK(吉2017-0005),長春市生物制品研究所有限責任公司;人參皂苷Rh1(純度>98%) 北京英納澤信化工技術研究所;氫溴酸東莨菪堿 山西玉寧生物公司;石杉堿甲 批號H10960133,上海復旦復華藥業有限公司;乙酰膽堿測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

ZH-800S跳臺儀 淮北正華生物儀器設備有限公司;BA-200小鼠避暗儀 成都泰盟科技有限公司;WMT-100S Morris水迷宮視頻跟蹤系統 成都泰盟軟件有限公司;SynergyTM2多功能酶標儀 美國Biotek公司;Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將小鼠放在室溫(22±1) ℃,濕度50%±5%環境下,12 h光暗周期(08:00 am～08:00 pm)適應5 d。小鼠被隨機分成6組(n=30),每組6只。空白組:灌胃10 mL/kg等劑量生理鹽水;陰性對照組:灌胃10 mL/kg等劑量生理鹽水;陽性對照組:灌胃66.7 μg/kg的石杉堿甲;人參皂苷Rh1低劑量組:灌胃5 mg/kg;人參皂苷 Rh1中劑量組:灌胃10 mg/kg;人參皂苷Rh1高劑量組:灌胃15 mg/kg。每天灌胃相應藥物共4周。除空白組外,其他實驗組每天(07:00 am～08:00 am)腹腔注射1 mg/kg的東莨菪堿,建立認知障礙模型。4周之后進行行為學試驗,試驗前1 h給予相應藥物,30 min之后腹腔注射1 mg/kg東莨菪堿[25]。

1.2.2 避暗試驗 潛伏期為每只小鼠從放入明室開始到第一次進入暗室后所遭電擊的時間。由于小鼠是夜間行進動物,本能會逃向暗處,在暗室以電擊刺激來訓練小鼠的空間學習記憶。訓練階段:將每只小鼠放入明室,5 s后將門升起,一旦動物完全進入暗室(所有爪子),立即關閉門,并且將32 V不可避免的電擊傳遞給小鼠的腳2 s。然后將小鼠移至明室,5 min后重復該過程。當小鼠連續5 min停留在光照室時,訓練結束。24 h后進行測驗,記錄每只小鼠進入暗室的潛伏期和5 min內進入暗室的錯誤次數。停止訓練5 d后進行消退試驗[26]。

1.2.3 跳臺試驗 跳臺試驗是一種普遍的對小鼠在藥物和其他干預措施之后進行神經行為學評估的方法。試驗時,小鼠放在箱內的絕緣平臺上到第一次跳下平臺的時間被稱為潛伏期。訓練階段:將小鼠預先放入暗箱中適應3 min后,立即用32 V交流電刺激,然后將小鼠放在平臺上適應一段時間。測驗階段:24 h后進行測驗,將小鼠放置在平臺上后開始計時,記錄潛伏期和5 min內的跳下平臺的錯誤次數。停止訓練5 d后進行消退試驗[27]。

1.2.4 Morris水迷宮試驗 此實驗是根據小鼠在水中有逃避水源的本能,并且會以最快的途徑逃出水源,學會逃避水源的過程體現小鼠的記憶力能力。此次試驗訓練階段為其5 d。將游泳池分為4個象限,將一個白色的逃生平臺放在水面以下0.5 cm并位于第2象限處,平臺的位置在實驗期間是固定的[28]。整個試驗期間水溫保持在(30±1) ℃,并在30 cm深的水里加入500 mL牛奶。訓練階段:第1 d,將小鼠放在平臺附近,允許其自行爬上3次,停留30 s后在下一象限繼續訓練。如果小鼠在90 s內沒有找到平臺,則將其引至平臺并在平臺上停留30 s,然后在下一象限進行訓練。之后的4 d訓練,每次都先將小鼠放在平臺附近,使其自行爬上1次,以進一步確定訓練結果。

表1 人參皂苷對小鼠避暗試驗的影響Table 1 Effects of ginsenosides on passive avoidance test in

注:陰性組與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與陰性組比較,*P<0.05,**P<0.01;表2,圖2～圖3、圖5同。

表2 人參皂苷對小鼠跳臺試驗的影響Table 2 Effects of ginsenosides on step-down avoidance test in

24 h后進行最后測驗。記錄60 s內每只小鼠爬上平臺所花費的時間以及小鼠的游泳路徑。動物行為由攝像機記錄并通過特定軟件分析[29]。

1.2.5 腦海馬體中乙酰膽堿含量測定 Morris水迷宮試驗完成后,按照Sultan[30]的方法立即將小鼠脫頸椎處死,然后在冰上解剖小鼠腦海馬體,存放于100%甲醇中勻漿脫蛋白。將勻漿離心(15000×g,4 ℃)10 min,并保存上清液[31],使用試劑盒測定Ach水平。

1.3 數據處理

數值表示為平均值±標準差。數據分析使用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0軟件,統計學顯著性設定P<0.05或P<0.01。

2 結果與分析

2.1 人參皂苷Rh1對小鼠避暗試驗的影響

如表1所示,與空白組相比,陰性對照組測驗潛伏期與測驗錯誤次數都極顯著高于空白組(P<0.01),說明造模有效。藥物治療后,Rh1低、中劑量組消退試驗潛伏期接近空白組;與陰性對照組相比,陽性對照組、Rh1低劑量組消退試驗潛伏期顯著增加(P<0.05),Rh1中劑量組極顯著提高(P<0.01)。與陰性對照組相比,陽性對照組和Rh1中劑量組的消退試驗錯誤次數顯著減少(P<0.05),且Rh1中劑量組略優于陽性對照組。在避暗試驗中,Rh1高劑量組對小鼠認知障礙的改善效果并不明顯。

2.2 人參皂苷Rh1對小鼠跳臺試驗的影響

如表2所示,與空白組比較,陰性對照組跳臺測驗潛伏期極顯著(P<0.01)縮短,測驗錯誤次數極顯著(P<0.01)增加,說明造模是有效的。陽性對照組和Rh1低、中劑量組與陰性對照組相比,消退試驗潛伏期明顯延長(P<0.05或P<0.01);Rh1三個劑量組的消退試驗錯誤次數也明顯減少(低、高劑量組P<0.05,中劑量組P<0.01)。Rh1中劑量組的療效與陽性對照組相近。

2.3 人參皂苷Rh1對小鼠Morris水迷宮試驗的影響

從圖2可知,陰性對照組與空白組相比,找到平臺的時間極顯著增加(P<0.01),說明其學習記憶能力明顯衰退。與陰性對照組進行比較,Rh1低、高劑量組找到平臺的時間顯著縮短(P<0.05);陽性對照組和Rh1中劑量組極顯著降低(P<0.01),且這兩組小鼠的游泳速度明顯快于陰性對照組(P<0.05，圖3)。圖4為部分小鼠的游泳路徑,空白組的小鼠可以快速且直接的找到平臺;陰性對照組的小鼠直到60 s結束仍未找到平臺;陽性對照組的小鼠最初游到泳池的第4象限,但很快找到位于第2象限的平臺;Rh1中劑量組的小鼠游泳路徑與陽性對照組相似,但在第4象限停留時間稍長;Rh1低、高劑量組的小鼠也可在60 s之內找到平臺,但比中劑量組的游泳路線更復雜。Rh1中劑量組游泳速度以及找到平臺的時間幾乎接近陽性對照組,意味著Rh1中劑量組最接近石杉堿甲的藥效。

圖2 人參皂苷對小鼠水迷宮試驗的影響Fig.2 Effects of ginsenosides on Morris water maze test in

圖3 人參皂苷對小鼠游泳速度的影響Fig.3 Effects of ginsenosides on

圖4 水迷宮試驗中各組小鼠的游泳路徑Fig.4 Representation of swimming paths during the Morris water maze test of mice注:a：空白組;b：陰性對照組;c：陽性對照組; d：Rh1-低;e：Rh1-中;f：Rh1-高。

圖5 人參皂苷對小鼠腦海馬體中 Ach含量的影響Fig.5 Effect of ginsenosides on Ach

2.4 人參皂苷Rh1對小鼠腦海馬體中Ach含量的影響

從圖5可以看出,東莨菪堿的干預降低了小鼠腦海馬體中Ach含量,而經過藥物治療之后,又可以顯著提高其含量(P<0.05)。其中,陽性對照組、Rh1低、中劑量組與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結論

隨著老齡化社會的到來,AD也逐漸成為了越來越嚴重的社會問題[32]。目前仍未發現有效的治療途徑能從根本上防治AD。人參皂苷作為人參的有效活性成分之一,具有對神經系統的保護作用,能夠有效防治AD[33]。崔婧[33]研究表明,人參皂苷Rg2可以抑制Aβ25-35導致的凋亡相關蛋白表達變化,從而達到抗阿爾茨海默病的作用。而Rh1作為Rg2的主要代謝產物,是否具有調節凋亡蛋白表達能力的藥理活性,其作用機制與Rg2是否相同,成為本研究關注的焦點。

本研究結果提示,Morris水迷宮實驗、跳臺試驗、避暗試驗中模型組小鼠潛伏期極顯著(P<0.01)延長、測驗錯誤次數多、有效區域游泳時間和路程長,說明模型組小鼠存在嚴重的認知障礙。給予人參皂苷Rh1后,小鼠逃避潛伏期顯著(P<0.05)縮短、消退試驗錯誤次數明顯減少、有效區域滯留時間和路程縮短、其空間辨別行為障礙顯著(P<0.05)改善,說明人參皂苷Rh1可對小鼠的認知能力有顯著(P<0.05)改善,對腦海馬體中Ach含量具有一定提高作用。從試驗結果可以看出,即使Rh1低劑量組,改善記憶的作用仍然明顯。在高劑量組,可能由于濃度過高(15 mg/kg),故其改善小鼠學習和記憶的作用沒有中劑量組明顯,原因有待進一步深入研究。Rh1中劑量的藥效更有助于小鼠改善記憶,由此確定Rh1中劑量(10 mg/kg)改善小鼠認知障礙的效果最好,且效果與石杉堿甲相當。

綜上所述,人參皂苷Rh1可以明顯提高AD模型小鼠海馬體中乙酰膽堿含量,為人參皂苷Rh1應用于AD的臨床治療提供了重要依據。