凝集素與TLRs信號通路的免疫調節作用

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(1.黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150500; 2.黑龍江大學生命科學學院,黑龍江省普通院校微生物重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150080; 3.西藏農牧學院食品科學學院,西藏林芝 860000)

凝集素是一類能夠凝集血紅細胞且具有糖特異性的蛋白質或糖蛋白[1]。凝集素最早是從蓖麻種子中發現的,后來又從動物體內中發現,在自然界中種類繁多、分布廣泛,微生物、動物、植物中均含有凝集素。凝集素參與生物的各種過程,包括細胞識別、細胞增殖、細胞遷移、細胞粘附于細胞外基質等。凝集素按照其來源可分為植物凝集素、動物凝集素和微生物凝集素。

前期學者對植物中的凝集素研究較為深入,大多是關于豆科植物種子的報道。現在越來越多的凝集素是從海洋生物中分離出來,現已知有300多種凝集素是從海洋生物中提取出來[2]。對這些海洋生物凝集素的研究都集中在具有生物醫學應用的抗菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗腫瘤劑、抗傷害感受劑和抗炎劑等方面。隨著大型真菌培養技術的發展,目前,已經從300多種大型真菌中分離提取出凝集素,并對其進行了初步研究[3]。研究表明凝集素具有抗腫瘤[4]、免疫調節[5]、抗病毒[6]等生物活性。在免疫調節過程中,凝集素可以發揮重要的作用。凝集素被定性為免疫調節劑,可誘導某些細胞因子和反應物的產生,對腫瘤或微生物的感染具有有效免疫應答的作用[7]。大多數凝集素可以通過Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)激活巨噬細胞,刺激T細胞、B細胞增殖,誘導細胞因子的分泌,發揮免疫調節作用。TLRs是非特異性免疫中的較為重要蛋白質分子,也是聯系特異性免疫和非特異性免疫的橋梁。TLRs在巨噬細胞識別細胞外信號中起到重要的作用。TLRs不僅可以參與非特異性免疫調節,還能誘導細胞因子表達,激活細胞信號通路。本文就TLRs的特征和凝集素對免疫調節作用的現狀進行概述。

1 凝集素分離純化及生物活性概述

1.1 凝集素分離純化

研究表明,不同來源凝集素的分離純化方法存在很大的相似性。主要是通過PBS浸提、硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析,如草菇凝集素[8]、黃牛肝菌凝集素[9]、雙孢蘑菇凝集素[10]、白蕓豆凝集素[11]、菜豆凝集素[12]等;也可以通過PBS浸提、硫酸銨沉淀、離子交換層析分離純化,如苦蕎凝集素[13]、大蒜凝集素[14]等;也有少數是通過PBS浸提、親和層析直接分離純化,如貽貝凝集素[15]等。在利用親和層析純化時,需要獲悉與待分離凝集素特應性結合的物質,配制相應親和層析膠。在提取未知凝集素時很難確認這種凝集素相應的配體,因此用親和層析純化存在一定的困難,這也是很少用這種方法的原因。

凝集素分離純化后需要分析鑒定它的性質,用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)和Native-PAGE(非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測凝集素的純度和分子質量[16];用Edman法檢測凝集素的N末端序列[17]。通過檢測分子質量、亞基數量、等電點、N末端序列等判斷凝集素的種類及結構特點,也可以通過傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射等方式檢測凝集素的高級結構[18]。結構決定功能,凝集素的結構與功能之間存在緊密的聯系。凝集素特殊的結構對于識別靶細胞表面的受體有著重要的意義。大多數凝集素表面具有特異性糖結合位點,這種特性是由凝集素特定的蛋白質結構決定[19]。凝集素可以凝集細胞表面的糖類物質,或者與周圍環境中的糖類物質結合形成糖蛋白,因此凝集素主要是以蛋白質或多糖復合物的形式存在,其多種生物活性可能與這種特性有關[1]。

1.2 凝集素生物活性

凝集素具有多種生物活性。在抗腫瘤方面,猴頭菇凝集素[20]可以抑制人乳腺癌MCF-7和人肝癌HepG2細胞的增殖;巴西毛果種子凝集素[21]可以抑制肺癌A549、人卵巢癌A2780、乳腺癌MCF-7的增值;巴西利馬豆凝集素[22]可以抑制鼠黑素瘤細胞的增值。在免疫調節方面,KML是一種從Korean mistletoe中分離到的一種凝集素,它可以調節巨噬細胞介導免疫反應,促進多種細胞因子(IL-3、TNF-α)的表達和ROS的產生,可以增強巨噬細胞的吞噬作用[23];用洋蔥凝集素ACA處理RAW264.7細胞及大鼠腹腔巨噬細胞24 h,NO、IL-12和TNF-α的表達量明顯增加[24]。在抗菌方面,樹舌凝集素可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌的生長[25];黑蕓豆凝集素在20 μg/mL時,可以抑制黑曲霉、香蕉尖孢鐮刀菌、錐栗炭疽病病菌、蓮細極鏈格孢菌、瓜果腐霉病菌、葡萄灰霉菌[26];桑葉凝集素可以抑制綠色木霉菌、蘋果落葉病菌、西瓜枯萎病菌、煙草黑脛菌等病菌[27]。在抗病毒方面,楊樹菇凝集素可以有效抑制煙草花葉病毒(TMV)[28]。繡球藤凝集素可以抑制牛痘病毒和水泡口炎病毒[29]。

2 TLRs信號通路概述

Toll樣受體首次發現于果蠅,因與果蠅蛋白Toll具有較高的同源性,故稱為Toll樣受體[30],之后在哺乳動物體內也發現了Toll樣受體的存在。TLRs是最早發現的天然免疫模式識別受體(PRRs),可以識別外源的病原菌相關分子模式(PAMPs)、內源的損害相關分子模式(DAMPs)和異源物先關分子模式(XAMPs)[31]。TLRs是一類Ⅰ型跨膜蛋白質,由三部分組成,包括亮氨酸重復序列、跨膜結構域和TIR結構域。TLRs與配體識別的關鍵部位是由19～25個亮氨酸重復序列組成的,活化TLRs的結構是TIR結構域[32]。TLRs主要在免疫細胞中表達,如巨噬細胞、樹突細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞等[33]。TLRs與相關接頭蛋白結合后,可以激活下游信號通路,誘導吞噬細胞、淋巴細胞等釋放炎癥介質,殺死外來的病原體[34]。TLRs是非特異性免疫識別的關鍵受體,在由炎癥反應、腫瘤等引起的免疫性疾病調節中起到重要的作用。食用菌凝集素免疫調節主要是通過刺激TLRs信號通路完成的。

2.1 TLRs家族成員的介紹

TLRs家族包含13個成員。在TLR家族這個大家庭中,根據它們在細胞中的定位和各自的PAMP(病原體相關分子模式)配體可以分成兩個亞組。TLR11與TLR5具有同源性,位于細胞表面;TLR13位于細胞囊泡中[35-36]。TLR10與TLR1相似,具有與TLR2形成二聚體的接口和脂肽結合的通道[37]。TLR1、2和6識別脂肽和糖脂,TLR7、8和9識別核酸如ssRNA和未甲基化的CpG DNA,TLR3區分與病毒感染相關的dsRNA、TLR4識別纖維蛋白、脂多糖(LPS)和熱休克蛋白,TLR5鑒定細菌鞭毛蛋白,TLRs 11和12識別肌動蛋白結合蛋白[38]。其中TLR4是發現的第一個人類細胞表面的TLRs受體蛋白,也是最復雜的,幾乎分布于所有細胞中[39]。

2.2 TLRs介導的細胞信號通路

圖1 TLRs信號通路活化機制Fig.1 Mechanism of TLRs signaling pathway activation注:P13K:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase);Akt:絲/蘇氨酸蛋白激酶B(serine/threonine kinase B);TAK-1:轉化生長因子激活激酶(TGF-β-activated kinase-1);MAPK:絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase);IκB:抑制劑-κB(inhibitor-κB);IKK:IκB激酶(IκB kinase);JNK:c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase);p38:p38蛋白(p38 protein);NF-κB:核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B);AP-1:激活蛋白-1(activating protein-1);IRF-3:干擾素調節因子-3(interferon regulatory factor-3)。

TLRs信號通路如圖1[40]所示,TLRs在細胞內信號傳導中起著重要的作用。凝集素與細胞表面的TLRs受體結合,激活TLRs,啟動下游信號,激活細胞內MAPK信號通路和NF-κB信號通路,調節腫瘤壞死因子、白細胞介素、干擾素等細胞因子的產生[41]。TLR受體與凝集素結合并激活TLR,激活后的TLR可以與MyD88結合,也可以與TRIF結合。

當TLR與MyD88結合后,可以啟動MyD88依賴途徑。MyD88募集IRAK家族成員并激活IRAK4、IRAK1、IRAK2和IRAKM[34]。IRAK4最初被激活,并且在MyD88下游的NF-κB和MAPK的激活中具有重要作用[42]。IRAK活化導致與TRAF6的相互作用,TRAF6是一種E3連接酶,其催化與靶蛋白上的K63(Lys63)連接的多聚泛蛋白的合成,包括TRAF6本身和IRAK1,以及二聚體E2遍在蛋白綴合酶Ubc13和Uev1A[43]。然后,K63連接的多聚泛蛋白鏈與TAB-2的新的鋅指型泛素結合結構域和激酶TAK-1復合物的調節組分TAB-3結合,以激活TAK-1[44]。TAK-1通過誘導MAPK激酶的磷酸化,同時激活ERK、p38和JNK,然后MAPK激酶激活各種轉錄因子(包括AP-1),并影響翻譯[45]。同時,K63連接的多聚泛蛋白鏈還可以與NEMO的泛素結合結構域結合,NEMO是NF-κB活化所需的IKK復合物的必需調節組分[46]。因此,K63多聚泛蛋白鏈可能是負責募集TAK-1以與IKK形成復合物,從而允許TAK-1通過其與IKK復合物的緊密接近來磷酸化IKKβ,其通過磷酸化和隨后的IκB蛋白降解導致NF-κB活化[47]。

當TLR與TRIF結合后,可以啟動TRIF依賴途徑。TRIF與P13K結合,誘導NF-κB的活化;TRIF與TRAF6結合,誘導IRF-3的活化,引起ITF-β的表達[48]。TRIF依賴途徑的下游有TRAF3和TRAF6兩個腫瘤壞死因子相關受體因子。研究結果表明,在缺少TRAF3時Ⅰ型干擾素產生量減少;缺少TRAF-6時Ⅰ型干擾素產生量沒有減少,這說明,TRAF-3在TRIF依賴途徑發揮重要的作用[49]。TRIF依賴途徑主可以調節干擾素相關蛋白的表達、誘導樹突細胞成熟和誘導ITF-β的表達等。

3 凝集素通過TLRs信號通路的免疫調節作用

3.1 微生物凝集素

大型真菌凝集素可以通過TLRs信號通路刺激免疫細胞的增殖提高巨噬細胞的吞噬作用以及增強細胞因子和炎性因子的分泌,并且TLRs在腫瘤免疫監視中也可能發揮作用[33]。大多數大型真菌凝集素是通過TLRs信號通路調節免疫系統的。如姬松茸刺激T細胞上的樹突狀細胞,作用CLRs凝集素受體指導T細胞實現內吞過程,分泌TNF-α,完成免疫調節作用[50]。靈芝凝集素在體外可以激活小鼠脾細胞,在體內具有免疫調節作用,能促進人外周血淋巴細胞有絲分裂[28]。表1列舉了幾種食用真菌凝集素通過TLRs信號通路的免疫調節作用[51]。

表1 幾種大型真菌凝集素誘導產生的細胞因子Table 1 Some large fungus lectins that induce cytokines production

表2 幾種植物凝集素誘導產生的細胞因子Table 2 Several plant lectins that induce cytokines production

3.2 植物凝集素

植物凝集素的免疫調節活性是它們與聚糖的相互作用,激活免疫細胞表面的受體有關,其相互作用可能觸發TLRs信號通路,產生某些細胞因子,相關細胞因子見表2[52]。因此,具有免疫調節作用的凝集素存在潛在的藥用價值。樹菠蘿凝集素與TLR2的糖基結合誘導IL-12的表達[53]。苦蕎麥凝集素可以刺激樹突細胞的成熟,調節機體免疫[54]。洋蔥凝集素可以刺激巨噬細胞RAW264.7,通過MAPK和NF-κB信號通路刺激促炎性因子TNF-α、IL-12和IFN-γ的表達[20]。扁豆凝集素與甘露糖/半乳糖特異結合能夠誘導鼠淋巴細胞產生IL-2。

3.3 動物凝集素

隨著對動物凝集素的深入研究,發現動物凝集素也可以通過TLRs信號通路進行免疫調節作用。貽貝凝集素與N-乙酰半乳糖胺/半乳糖特異性結合后分別處理鼠巨噬細胞RAW264.7、鼠骨髓巨噬細胞、人巨噬細胞THP-1,通過活性氧ROS、絲裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C-α/δ和NF-κB等途徑使得NO、TNF-α、IL-6的釋放量均明顯增加[55]。蛇毒C型凝集素通過MAPK和NF-κB信號通路激活巨噬細胞,調節機體免疫[56]。家蛹凝集素可以通過TLR4/NF-κB信號通路,使iNOS表達和NO合成與釋放[57]。

4 展望

凝集素在自然界分布廣泛,且具有多種生物活性。存在于免疫細胞表面的凝集素和聚糖物質之間的相互作用可能引發分化免疫調節作用,包括細胞增殖和激活以及細胞因子產生的刺激[58-59]。先天免疫系統是保護人體免受微生物、過敏原和癌癥侵害的核心。TLR家族及其下游細胞內信號分子在先天免疫中起著重要作用,這些信號通路的激活導致各種抗炎和促炎癥分子的表達,這些分子調節代謝和體內平衡[60]。通過TLRs可調控炎性反應,為以后疾病的預防和治療提供新的治療策略[61]。凝集素通過TLRs信號通路,可以誘導白細胞介素、干擾素等細胞因子的產生,還可以刺激巨噬細胞、樹突細胞等免疫細胞的增殖與分化。大型真菌凝集素能刺激淋巴細胞轉化為淋巴母細胞,可以通過檢測淋巴母細胞的轉化情況,反應細胞免疫水平,監視免疫調節情況。

利用凝集素的免疫調節作用預防治療疾病將成為凝集素的最重要的研究方向。凝集素的快速發展也為開發保健性食品或藥物提供了重要的依據。雖然凝集素對的免疫調節已經研究了很多,但是由于凝集素的種類眾多,所以對于每種凝集素具體的調節作用還需具體研究,不能以偏概全。