小鵝瘟病毒與H9N2禽流感病毒混合感染的綜合診治

秦磊 郭繼紅

1 發(fā)病情況

2017 年3月4日，遂平縣某養(yǎng)鵝場(chǎng)養(yǎng)殖的3000只6日齡揚(yáng)州白鵝發(fā)病，開(kāi)始出現(xiàn)個(gè)別雛鵝發(fā)病，第2 天鵝群的發(fā)病數(shù)量增多，出現(xiàn)40～50 只病鵝，之后每天都有150只左右的雛鵝發(fā)病，鵝群的病死率較高，可達(dá)70%～80%。鵝群發(fā)病后養(yǎng)殖人員采用了雙黃連及環(huán)丙沙星飲水，鵝群的發(fā)病率有所控制，但發(fā)病鵝及死亡鵝的數(shù)量依然出現(xiàn)較多。養(yǎng)殖人員采集10只病死鵝病料，前來(lái)就診。

2 臨床癥狀及病變

發(fā)病雛鵝主要表現(xiàn)為精神沉郁，采食量下降，排出白色稀糞，有的病鵝出現(xiàn)咳嗽、氣喘、呼吸困難等呼吸道癥狀，有的死前出現(xiàn)角弓反張、倒地震顫等神經(jīng)癥狀。剖檢病死鵝，主要表現(xiàn)為肺臟出血、淤血，氣囊渾濁，腸管高度腫脹，剖開(kāi)管腔可見(jiàn)灰白色纖維素性栓子，病情嚴(yán)重者其腸管纖維素栓子的長(zhǎng)度可達(dá)20 cm 左右。

3 病原檢測(cè)

3. 1 細(xì)菌分離鑒定 采用接種環(huán)，無(wú)菌取病死鵝的肺臟及肝臟，分別在普通培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng) 18～24 h，觀察菌落的形態(tài)。細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果顯示，普通培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基中均無(wú)任何細(xì)菌的生長(zhǎng)，表明發(fā)病鵝群未感染細(xì)菌。

3. 2 病毒檢測(cè) 無(wú)菌采集病死鵝的脾臟或肝臟，分別進(jìn)行組織總DNA 和總 RNA 的提取。以其為模板，分別進(jìn)行小鵝瘟病毒 （GPV） 、H9N2 禽流感病毒 （AIV） 、新城疫病毒 （NDV） 的常規(guī)PCR和RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。GPV和 H9N2AIV 的PCR引物分別根據(jù)Gen Bank上發(fā)布的基因序列，比對(duì)后選取保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。GPV 的引物序列為： 上游引物： 5' - CAACGCAGGATCAGACGAA -GAC - 3'， 下 游 引 物： 5' - AGCGAACATGCTATG-GAAAGGA-3'，擴(kuò)增目的基因大小為 314 bp。N9N2AIV 的引物序列為： 上游引物： 5' - GGAGGTTGGT-CAGGATTAGTTG-3'，下游引物： 5' - ACAAGAGAT-GAGGCGACAGT-3'，擴(kuò)增目的基因大小為 560 bp。NDV 的檢測(cè)引物采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增目的基因大小為 500 bp左右。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。擴(kuò)增的目的基因送上海生物工程有限公司進(jìn)行基因序列的測(cè)定。PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，在310 bp 和 560bp 左右的位置出現(xiàn)了2條目的條帶，而在 500 bp位置未出現(xiàn)任何條帶。將擴(kuò)增的 310 bp 和 560 bp 目的基因進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與 Gen Bank 上發(fā)布的核苷酸序列比對(duì)分析，分析結(jié)果顯示 310 bp 的基因序列與 GPV核苷酸序列的同源性可達(dá) 99. 9%，560bp 的基因序列與N9N2 AIV核苷酸序列的同源性可達(dá)99. 7%。因此，PCR 檢測(cè)與測(cè)序結(jié)果表明，從病死鵝內(nèi)臟器官中檢測(cè)出了 GPV和 H9N2 AIV 兩種病毒，未檢測(cè)到 NDV。

4 診斷

根據(jù)鵝群的發(fā)病日齡、臨床癥狀及病變特點(diǎn)，初步診斷該鵝群可能感染了GPV。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果表明，從病死鵝體內(nèi)沒(méi)有分離到任何病原菌，PCR檢測(cè)及目的基因測(cè)序結(jié)果顯示，病死鵝的內(nèi)臟器官中可檢測(cè)到GPV和H9N2 AIV兩種病毒。因此該鵝群最終確診為GPV和H9N2 AIV兩種病毒混合感染。

5 治療

5. 1 抗體治療 將病鵝隔離飼養(yǎng)，清潔鵝舍，保持鵝舍的通風(fēng)。加強(qiáng)消毒，對(duì)鵝舍、料槽、水槽及周圍環(huán)境用百毒殺溶液進(jìn)行消毒，每天2 次，連續(xù) 1 周。剩余鵝群均注射小鵝瘟病毒的卵黃抗體，對(duì)尚未發(fā)病的鵝群每只注射 0. 5 m L，對(duì)已出現(xiàn)癥狀的每只注射 2 ～ 3 m L。抗體注射以后，新發(fā)病例的出現(xiàn)顯著降低，病情輕微者明顯好轉(zhuǎn)。

5. 2 對(duì)癥治療 給予鵝群充足的飲水，同時(shí)在飲水中添加黃芪多糖或雙黃連等抗病毒中藥，配合頭孢氨芐或環(huán)丙沙星抗生素防止出現(xiàn)細(xì)菌的繼發(fā)感染。飲水中還可以添加電解多維、Vc 等，以增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。采取以上措施后，鵝群的發(fā)病和死亡均得到了有效的控制，有的病鵝逐漸康復(fù)，為鵝場(chǎng)大大降低了經(jīng)濟(jì)損失。

6 討論

GPV 屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬的成員，為單股線性 DNA。該病毒基因組全長(zhǎng) 5 106 bp，含有 2個(gè)開(kāi)發(fā)閱讀框 （ORF） ，ORF1 主要編碼 2 種非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1 和 NS2，ORF2 編碼 3 種結(jié)構(gòu)蛋白 VP1、VP2 和 VP3。其中 VP3 蛋白是 GPV 主要的衣殼蛋白，含有多個(gè)抗原表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此該蛋白在 GPV 檢測(cè)方法的建立及防治措施的研究方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。本文 GPV 的檢測(cè)根據(jù) VP3 基因保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定的方法確定了鵝群 GPV 的感染。H9N2 AIV 屬于低致病性流感病毒，該病毒宿主范圍廣，各種禽類均易感，感染后主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，腫眼、流淚，有的還出現(xiàn)抽搐、癱瘓等神經(jīng)癥狀，剖檢主要表現(xiàn)為肺臟出血水腫，氣管中出現(xiàn)纖維素性滲出等。血凝素 （HA） 和神經(jīng)氨酸酶（NA）是禽流感病毒主要的抗蛋白，在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的抗體。本文流感病毒的檢測(cè)就是根據(jù) HA 基因保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物，通過(guò) RT-PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定的方法確定了鵝群 H9N2 AIV 的感染。

通過(guò)對(duì)發(fā)病鵝群臨床癥狀及病變的觀察，同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，PCR 擴(kuò)增和目的基因序列測(cè)定，最終確定了該鵝群為 GPV 和 H9N2 AIV 混合感染。小鵝瘟發(fā)病后的最佳治療方式是抗體療法，通過(guò)對(duì)剩余鵝群注射小鵝瘟病毒卵黃抗體治療，同時(shí)采用對(duì)癥治療，鵝群的疫情很快得以控制，為鵝場(chǎng)降低了經(jīng)濟(jì)損失。本文通過(guò)鵝群GPV 和 H9N2 AIV 混合感染病例的診斷及治療，為臨床上鵝群傳染病混合感染的診治提供了技術(shù)參考。

（作者單位：463100河南省遂平縣畜牧局）