擬南芥中高效創制不攜帶轉基因元件多重突變體的CRISPR/Cas9 基因編輯系統

在植物基因編輯的過程中去除CRISPR/Cas9 表達元件非常重要，因為CRISPR/Cas9 表達元件在植物中的存在會帶來多方面的問題：（1）取部分組織進行基因型檢測時很難區分突變是遺傳自上一代還是當代新產生的（當代新產生的體細胞突變可能不能遺傳）；（2）CRISPR/Cas9 元件的持續存在既增加了脫靶的風險，又不利于開展后續的互補實驗；（3）攜帶CRISPR/Cas9元件的植物屬于轉基因植物，獲得商業應用的難度大大增加。

近日，北京大學現代農學院與生命科學學院陳浩東研究組在aBIOTECH 期刊發表了題為“A novel CRISPR/Cas9 system for efficiently generating Cas9-free multiplex mutants inArabidopsis”的研究論文，報道了一種高效地在擬南芥中創制多基因編輯的不攜帶轉基因元件（Cas9-free）植株的方法，該方法也可能在其他植物中類似應用。

研究者構建了Cas9-P2A-GFP 融合蛋白，其中P2A 是可以發生自我斷裂的小肽，這樣GFP 不影響Cas9 的核酸內切酶活性。結合同尾酶介導的串聯多個sgRNA 的技術，該系統可實現多基因編輯。因GFP 與Cas9 的等量表達，通過觀測GFP 的熒光，即可獲得Cas9 蛋白的存在與否及含量高低的信息，而Cas9 蛋白的含量高低與基因編輯的效率具有很好的正相關性。由此，使用者在T1 代中挑選GFP 熒光強的植株，這些植株有很高的概率發生基因編輯，對目標序列鑒定確認發生編輯后，收集這些植株的T2 代種子；在T2 植株中挑選沒有GFP 表達的植株，即為目標Cas9-free 植株。因 T1 代熒光弱的植株可直接舍棄，T2 代直接挑選無熒光的植株，大大減少了基因型鑒定的工作量，提高了研究效率。