PAS 蛋白融合修飾研究進展

韓斐 江明鋒 冉嫆 王剛

（1. 西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041；2. 四川大學國家生物醫學材料工程研究中心，成都 610064）

隨著分子生物學的發展，由于多肽藥物具有作用專一、高效等優點，目前多肽類藥物的研制和應用已成為生物醫藥產業發展的熱點，其中包括生長因子、細胞因子、單克隆抗體和酶等［1］。然而，多肽作為藥物注射入生物體內時存在很多問題，如免疫原性強、半衰期短、酶解性強及溶解度較低等。其中半衰期短問題嚴重制約了小肽類藥物的發展，這主要是由于分子量低于腎小球過濾閾值（閾值約60-70 kD），使得血液中的藥物在通過腎臟時快速被清除，從而大大降低了多肽類藥物的在血漿的半衰期［2］。因此，需要提高用藥的劑量以及用藥頻率來維持藥物在體內的有效濃度，這樣給患者增添了許多苦惱。PEG 化（PEGylation）是20 世紀70 年代后期發展起來的一項熱門蛋白修飾技術，PEG 是一類高分子多聚物，目前廣泛應用于多種蛋白質藥物或非蛋白質藥物的修飾，可以有效地增加小肽類藥物的流體力學體積，延長在體內的半衰期［3-5］。但是近期的研究發現，經PGE 修飾的藥物在患者長期治療過程中會導致一系列問題，如腎臟空泡化和聚合物在體內積累［6］，甚至有報道稱在生物體內發現了PEG 生物制品抗體［7-10］，這些都使得PEG 藥物安全性引起廣泛的關注。

PAS 蛋白修飾（PASylation）是近幾年發展起來的融合蛋白修飾的技術，在蛋白類藥物的N 端或者C 端連接由脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）組成的序列進行融合表達［11］。PAS 序列是親水、不帶電的生物聚合物，具有與聚乙二醇（PEG）非常相似的生物物理性質，可以形成一個天然的非結構多肽鏈，并且具有大的流體力學體積和較高的溶解度。與PEG 化學修飾相比，PAS 融合蛋白在細胞表面的受體攝取后會被胞內的溶酶體蛋白酶快速降解，有效避免了在細胞中沉積。此外，PAS 序列是由3 個天然氨基酸組成的，且形成的高級結構較簡單，因此適用于目前常見的生物表達體系，通過基因工程技術的生產方式可以大大減少成本［12］。目前PAS 修飾蛋白技術已被用于延長各種生物制品在生物體內的血漿半衰期，如抗體Fad 片段、生長激素、酶和干擾素等。

1 PAS 序列設計

1.1 氨基酸的選擇

PEG 高聚物具有親水性高，流體力學體積較大及不帶電性的特點，為了使得組成的氨基酸序列具有類似的物理特性，首先將帶電性的以及具有疏水性側鏈且疏水性較強的氨基酸排除，在剩下的電中性且親水能力較強的氨基酸中，其中天門冬氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸由于具有較強的趨勢形成一個有規則的結構而被排除；組氨酸因為有較強的趨向與金屬離子相互作用而被排除［11］，所以選中的3 個氨基酸分別是脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸。

1.2 PAS序列的順序

在確定了構建序列的氨基酸種類后，對Pro、Ala 和Ser 這3 個氨基酸的排列順序進行優化，使其所形成的高級結構與PEG 聚合物具有相似的無規則卷曲結構，并通過計算模擬其序列的混亂熵值使其達到較高水平［12］。例如，這3 個氨基酸在二級結構上形成功能結構的趨勢應該盡可能相互消減，設計過程中要多考慮脯氨酸氨基端的反式異構結構，因為可以增加整條肽鏈的混亂熵值。此外，最大限度避免兩個或者兩個以上相同氨基酸的連接等，通過這些原則可以最大程度上避免α 螺旋，β 折疊等規則二級結構的形成［11］。

2 PAS 蛋白修飾技術的優勢

2.1 蛋白PAS修飾有望取代PEG修飾

蛋白PAS 修飾是借助于天然氨基酸Pro、Ala 和Ser 組成的序列，在結構等物理特性方面參照PEG并通過與小分子多肽形成融合蛋白的形式而發展起來的蛋白修飾技術。PAS 修飾蛋白和PEG 蛋白聚合物具有相似的生物物理性質和結構特點：在生理的條件下，兩者具有較高的可溶性，在溶液中都呈現出無規則卷曲的結構。因此，可以在不影響蛋白質功能的情況下增加其流體力學體積，從而顯著延長了PAS 修飾蛋白的血漿半衰期。目前，在PAS 修飾藥物分別對多個物種（如小鼠、大鼠、豬、狗和非人類靈長類）藥理活性的檢測中發現，PAS 修飾的藥物除了保持PEG 修飾的優越性外，還彌補了其很多不足，如生產成本高、生物活性損失和安全性低等問題［13］。

2.2 生產成本較低

目前應用于臨床藥物生產的PEG 原料價格較為昂貴，而且在蛋白質藥物PEG 修飾過程中的偶合和純化步驟中活性損失率普遍較高［14-15］，因此大規模生產PEG 修飾多肽類藥物成本昂貴，且工序較為繁瑣。相比之下，因脯氨酸、丙氨酸、絲氨酸這3 種氨基酸組合形成PAS 序列的高級結構較為簡單，所以適用于目前所有常見表達系統，包括哺乳動物細 胞（CHO、HEK、COS）、 酵 母（Pichia pastoris、（Kluyveromyceslactis lactis）、大腸桿菌或革蘭氏陽性菌等［11］，借助基因工程的手段可大大降低生產成本以及繁瑣的生產工藝。

2.3 生物活性損失小

在PEG 修飾蛋白的過程中，通過Lys 側鏈的修飾通常會降低藥物的生物活性，如PEG 修飾的干擾素（IFNα2a）和白細胞介素-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）等，與未經修飾相比，只保留了10%的活性［16-17］。目前，還未見通過PAS 修飾的蛋白藥物藥理活性損失的報道。

2.4 較高的溶解度

通過基因編碼的PAS 序列在多種情況下都是單分散性的，有相關實驗對相同分子量大小的PAS 和PEG 修飾的同種蛋白聚合物進行了物理性質比較，發現PAS 融合蛋白的黏度較低，比PEG 修飾的蛋白展現出更高的親水性及溶解度［18］。這大大增加臨床上注射給藥方式的效率。同時，在大量的動物實驗中觀察到，通過皮下或肌肉注射的方式，PAS 修飾藥物展現出了更高的生物利用度［12，19］。

2.5 生物安全性

早期的研究認為，PEG 是通過保護非本體蛋白質不受機體中的抗體或免疫細胞監管來降低藥物免疫原性的，一直認為是生物惰性材料［20］。然而隨著越來越多的PEG 化藥物進入臨床應用，關于患者體內抗PEG 抗體的產生并造成藥效損失的報道不斷增多［7-10］，加之PEG 是一種高聚化學分子，生物降解性較低，長期服用后會導致PEG 在體內的沉積，引起細胞空泡化，對組織造成不可估量的損傷。最近，美國食品藥品監督管理局（FDA）對9 種已上市PEG 修飾蛋白藥物進行審查，結果發現Omontys、Cimzia、Macugen、Krystexxa 和Somavert 這5 種藥物可以促使細胞空泡的形成，還發現細胞中空泡出現的頻率與PEG 在體內的累積劑量成正相關［6］。例如，PEG 修飾的Fab 片段cimzia，按照每次400 mg 的劑量，兩周給藥一次的頻率，一段時間后分別在肝內巨噬細胞，庫普弗細胞以及脾內網狀內皮細胞等吞噬細胞中出現PEG 沉積。此外，在腎小管上皮細胞和脈絡叢上皮細胞中也觀察到了空泡的形成［21-22］。歐洲藥品管理局（EMA）也下達了針對兒童人群謹慎使用PEG 修飾藥物的指令［23］。相比之下，P、A、S 這3 個氨基酸自身屬于生物體的天然物質，通過PAS 修飾的小分子藥物在血漿中不具有免疫原性且穩定性強，重要的是在相關細胞攝取后，它們很快被細胞內溶酶體蛋白酶降解，有效防止了在細胞的空泡化。

3 PAS 蛋白修飾技術的應用

3.1 蛋白質藥物的修飾

目前，PAS 技術已成功應用于很多功能性蛋白的修飾，包括人生長激素（hGH）［24］、IFN-α2b 抗體片段［11］、IFN-β1b 抗體片段［25］、瘦素［19，26］、紅細胞生成素（EPO）［27］和白細胞介素-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）［12］等，這些修飾后的蛋白均顯著增加了流體力學體積，延長了其血漿半衰期，提高了多肽藥物的藥理活性。

3.2 Fad抗體片段的修飾

位于單克隆抗體（mAbs）上的抗原結合片段（Fabs），因其可以有效的識別癌癥的一些標志性的抗原，并成功應用于一些腫瘤的治療中［28-29］，所以是目前增長最快的一類生物治療藥物。其中有一些帶有放射性的Fabs 免疫偶聯物，如Zevalin，在臨床治療中的腫瘤靶向性方面具有廣闊的應用前景，但是由于它們體積較小，腎臟清除速度很快（在人體內為數分鐘到數小時），通常會導致示蹤劑在靶向腫瘤組織的積累不充分，從而導致腫瘤成像不均勻且具有較高的背景信號等缺點［30-32］。而經PAS 修飾過后的αher2-Fab 抗體片段，增加了在體內的半衰期，優化后腫瘤成像中信號與背景成像比例提高到原來的12.2 倍［33］。從高效和安全性的角度來考慮，PAS對抗體片段的修飾在腫瘤成像和診斷的應用中有著廣闊的前景和巨大的應用價值。

3.3 納米載體的修飾

有報道稱，用PAS 修飾的鐵蛋白做納米載體并成功靶向遞送了阿霉素［34］。鐵蛋白是一種機體內貯存鐵的可溶組織蛋白，可以選擇性地結合到轉鐵蛋白受體I 上［35］。鐵蛋白N 端與40 個殘基的PAS 序列相連組成的融合鐵蛋白，與未經修飾的鐵蛋白相比，提高了其穩定性和溶解性，鐵蛋白裝載藥物的回收率從50%提高到了95%。同時，PAS 序列增加了蛋白的產率，每1 L 大腸桿菌培養物的產量增加約100 mg。此外，還發現PAS 修飾的鐵蛋白對阿霉素的載藥量增加了3 倍，并極大程度提高了穩定性，在4℃條件下，PBS 中儲存3 個月后無沉淀析出，藥物泄漏量僅為10%，而在未經修飾的鐵蛋白中，在僅兩周后就可以達到50%泄漏量［34］，可見PAS 對納米載體的修飾可以大大增加其穩定性。

3.4 融合蛋白linker

由于P、A、S 這3 個氨基酸及其序列順序可以形成一個無序卷曲的結構，在二級機構上避免了功能性結構區域的出現，從而最大限度保持了本體蛋白功能的完整性［11］。因此可作為linker 用于多個功能蛋白的連接，這樣不但可以作為活性增強的生物技術催化劑用于工業化生產，而且可以用于一些復雜疾病的治療。例如，通過PAS 序列（60）將左旋二酮還原酶與ω-氨基轉移酶連接進行融合表達，雖然這種融合肽與單個生物的催化酶活性相比略有降低，但是在異山梨酯等工業相關氨基醇的制備過程中的氧化耦合以及轉氨化反應中，與平時工業生產中所用的分離酶混合物相比，其活性得到顯著的增強［36］。除此以外，GLP-1 類似物exextin-4 通過PAS（600）序列與胃腸激素肽YY3-36 融合表達，這種融合肽除了保留這兩種肽各自的活性外，還將其在小鼠的血漿半衰期延長到16 h。目前，在慢性代謝紊亂、糖尿病及肥胖癥等復雜疾病中，單一藥物治療的效果往往不盡人意，相比之下，聯合作用藥物的治療有更強的優勢［37］。通過PAS 序列連接，并借助生物技術工程的手段生產多功能的融合肽具有高效、廉價和簡單等優點。目前，PAS 序列作為linker用于多個功能蛋白的連接還在不斷地被探索，無論對于工業生產還是藥物研發都有著巨大的潛力和經濟價值。

3.5 其他多肽血漿半衰期延長的修飾技術

除了基于不帶電性的PAS 多肽蛋白修飾技術之外，近年來還出現了與陰離子氨基酸組合而成的聚合物進行融合表達，由于腎基底膜帶負電荷，從而通過與腎基底膜形成相互排斥的作用力來減緩腎代謝速率，增加藥物在血漿中的半衰期［38］。例如，膠狀蛋白質聚合物（GLK），它是由P、S、G、N、Q、E、K、A 等陰離子氨基酸組合而成的短肽鏈，粒細胞集落刺激因子（GCSF）在N-端結合116 個殘基的GLK 短肽后，其融合肽產物通過皮下注射的給藥方式，發現經修飾過的GCSF 在小鼠體內血漿半衰期增加到5.7 倍［39］。目前已知GLK 融合蛋白只適用于畢赤酵母，在大腸桿菌中的產量非常低，其他表達系統中還未見報道［40］。XTEN 也是整體帶負電荷且應用較廣泛的非結構多肽，XTEN 多肽由P、E、S、T、A、G 等氨基酸組成，目前已成功應用于人體生長激素［41］、凝血因子VIII、IX［42］、胰高血糖素［43］、胰高血糖素樣肽類似物［44］及exenatide［42］等。例如，在人體生長激素連接一定長度的XTEN 多肽，通過皮下注射后可將藥物半衰期延長到100 個小時，是未修飾人體生長激素的55 倍［41］。在胰高血糖素的C-端連接144 個殘基的XTEN 多肽后，同樣是通過皮下注射的方式給食蟹猴進藥，將半衰期延長到6 h［43］。但是，由于XTEN 序列本身帶有較高的負電荷，在與腎基底膜產生相互排斥的同時，也會改變被修飾蛋白的帶電性，從而導致與其細胞表面受體的親和力下降，藥物的藥理活性損失較大。例如，經XTEN 修飾過后的胰高血糖素只保留了最初活性的15%［43］。此外，人血清蛋白（HSA）是人體血液中含量最高的單一蛋白，具有無免疫原型，人體相容性好，血漿半衰期較長等優點，因此融合后可延長藥物半衰期，目前公布的臨床結果表明HSA-IFNα融合蛋白Albuferon 的半衰期長可延長到145 h，并進入了II 期臨床研究［45］。但由于人血清蛋白的結構較為復雜，其制備純化工藝較為繁瑣且活性損失較大，這一缺點限制了其在市場的廣泛流行。另外，多聚唾液酸是N-乙酰神經氨酸的多聚分子，可用作蛋白藥物的緩釋材料，由于多聚唾液酸本身的功能，因此在神經修復，神經創傷愈合等材料的修飾中具有廣闊的前景［46］。

4 總結與展望

綜上所述，PAS 修飾是一項比較新的技術。目前，已成功應用于多種功能肽的修飾，有效提高被修飾蛋白在血漿中的半衰期，增加藥理活性。這種借助于天然氨基酸，形成具有與PEG 聚合物類似結構的蛋白修飾的方法，目前還在被進一步探索，并被認為是最有前景的可以替代聚乙二醇化蛋白修飾技術。與其他基于多肽的氨基酸修飾技術相比，PAS 序列的不帶電性和形成無序環狀結構等特性方面與PEG修飾最為相似，因此具有幾乎相同的生物物理特性。而PAS 修飾與PEG 修飾相比，前者可借助現代生物工程技術進行融合表達來實現；與PEG 的化學偶聯修飾相比，PAS 修飾技術在生產和應用方面變得簡化和廉價，更重要的是，天然氨基酸成分在體內的無痕跡代謝也為PAS 修飾藥物應用提供了一個更好的前景。

目前，PAS 融合序列已被應用到蛋白修飾的多個領域。PAS 修飾的多肽類藥物在體內成功增加了其血漿半衰期，提高藥物的藥理活性，并被廣泛的應用于多種生物制劑。同時，PAS 修飾技術在體內腫瘤成像和藥物傳遞系統中也有著極高的應用價值，如PAS 修飾后的抗原結合片段，可以在沒有相關副作用的前提下優化了腫瘤成像，經PAS 修飾過后的鐵蛋白納米載體，載藥量及其穩定性都大幅度提升。此外，PAS 序列作為linker 被應用在聯合作用藥物中，如雙功能肽，這樣不但簡化制造過程，降低了成本，又延長了體內循環時間，因此PAS 序列在多功能融合蛋白的是生產中具有較高的應用價值。綜上，隨著PEG 修飾藥物的弊端不斷被發現，尋找PEG 化以外的更為安全有效的方法是非常有必要的。而PAS修飾在彌補了PEG 修飾不足的同時，在許多方面都展現出與PEG 化有著近乎相同的特點，與其他多肽修飾技術相比，其簡單的制備工藝也非常有利于大規模的生產，同時應用也較為廣泛。因此，PAS 修飾技術對小肽藥物的發展有著巨大的潛力。但PAS修飾技術是一項新興的技術，對其探索還未成熟，我們需要進一步了解PAS 的長度與被修飾蛋白的關系以及PAS 這3 個氨基酸分別在被修飾的多肽中所起的功能作用，這樣可以在小分子藥物的發展中發揮出更大的優勢。