4 個鮮食葡萄品種組培快繁體系的建立

蔡文博 段 虹 王 軍 朱元娣

(1中國農業大學園藝學院,北京 100193;2中國農業大學食品科學與營養學院,北京 100083)

中國是世界葡萄(Vitis vinifera L.)生產大國,自2011年起鮮食葡萄產量已位居世界首位,2014年起葡萄栽培面積躍居世界第2 位[1],截至2015年底,栽培面積達79.9 萬hm2,產量達1 366.9 萬t。 我國葡萄生產以鮮食葡萄為主,占80%左右,葡萄苗木標準化生產是產業發展的基礎[2-3]。 葡萄可以通過扦插或嫁接等方法進行無性繁殖,但周期長且易積累病害。 植物組織培養技術能夠不受季節的限制,快速繁殖優質的葡萄苗木,同時降低成本[4-6]。 因此,建立有效的鮮食葡萄品種組培快繁體系,不僅可以滿足優質苗木的商業化生產需求,還能為優質葡萄市場提供技術參考。

常規的組培快繁體系包括無菌外植體的建立、啟動培養、繼代培養和馴化移栽四個環節[7]。 外植體的選擇是葡萄組培快繁的第一步。 選取長新梢(10 cm)作為外植體,有利于誘導不定芽的發生[8-9]。 培養基成分與配比能夠影響外植體的啟動培養和繁殖體的增殖效率[10]。 研究表明,添加2 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤(6-benzylamino purine,6-BA)和0.2 mg·L-1萘乙酸(1-naphthlcetic acid, NAA)的MS 培養基作為巨峰的初代培養基,2.0 ～5.0 cm 新梢為外植體,萌芽率達到71.1%[11];MS 培養基添加0.2 mg·L-13-吲哚丁酸(3-indolebutyric acid, IBA)、1.0 mg·L-16-BA 和0.5 mg·L-16-糠氨基嘌呤(kinetin, KT)啟動培養釀酒葡萄莖段外植體,萌芽率達73%以上,側芽萌發生長狀況良好[12]。 繼代過程中,繁殖體在不同培養基上的生長情況不同,1/2 MS 培養基有利于Dixie 和Fry 葡萄莖段的增殖增長[8-9,13];木本植物培養基(woody plant medium,WPM)促使葡萄砧木3309 和SO4 生長良好,生根率近100%[14],但圓葉葡萄品種如Carlos 和Fry在WPM 培養基上長勢較差,表現出嚴重的玻璃化現象[15-16]。 培養基中附加的激素如3 - 吲哚乙酸(3-indoleacetic acid, IAA)、IBA、6-BA、苯基噻二唑基脲(thidiazuron, TDZ)和KT 等影響葡萄組培苗的增殖和生根[10,16]。 利用添加0.2 mg·L-1IBA 的改良B5培養基作為無核白和弗萊姆的繼代培養基,增殖與生根培養可同時進行,減少了操作[10,17]。 組培苗馴化移栽是最終的重要環節,不同煉苗方式影響組培苗移栽成活率。 光培法是馴化葡萄組培苗的常規方法,但成活率不高,為60%以上,這主要是由于在煉苗過程中,易產生大量霉菌,組培苗的根系易受傷害[6,12,18]。 但光培煉苗后進行沙培煉苗,成活率可達到90%以上[10]。利用水培煉苗的方法馴化蘋果組培苗,將組培苗放入改良的霍格蘭德半營養液中,能夠極大提高蘋果組培苗移栽成活率[19-20]。

目前,已建立的多個葡萄品種的組培快速繁殖體系間存在差異,但可用于不同葡萄品種的組培快繁體系較少,不利于將組培快繁技術轉化制葡萄苗木繁殖的商業化生產中。 本研究以4 個鮮食品種夏黑、紅地球、巨峰和玫瑰香為試驗材料,通過探索無菌外植體接種、啟動培養、增殖生根培養和馴化移栽環節的關鍵技術,建立適用于不同鮮食葡萄品種的組培快繁體系,以期為鮮食葡萄苗木繁育和商品化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2015年11月在中國農業大學上莊實驗站采集夏黑、紅地球、巨峰和玫瑰香4 個鮮食葡萄品種的冬季休眠枝條作為建立鮮食葡萄快繁體系的試驗材料。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 外植體消毒及啟動培養 冬季采集葡萄休眠枝條,45℃恒溫水浴處理不同時間(1.5、3 和4 h),每種處理包含40 個枝條;然后在室溫下(21±2℃),水培促進冬芽萌發,每隔3～4 d 換一次水,待新梢生長至長度為10～15 cm 時采樣,剪切約10 cm 莖段作為外植體,進行表面消毒;用加入洗滌靈的水充分清洗后,于超凈臺內進行表面消毒。 分別進行2 個消毒處理過程:1)高濃度(3%)次氯酸鈉處理:用70%酒精消毒10～30 s(幼嫩外植體消毒時間短),無菌水沖洗2～3 次,3%次氯酸鈉消毒10 min,無菌水沖洗4～5 遍,最后用滅菌的濾紙吸去莖段表面多余水分,為接種備用;2)低濃度(0.3%～0.5%)氯酸鈉處理:用70%酒精消毒10～30 s(幼嫩外植體消毒時間短),無菌水沖洗2～3 次,0.3%～0.5%次氯酸鈉消毒15 min,無菌水沖洗4～5 遍,最后用滅菌的濾紙吸去莖段表面多余水分,為接種備用。

每個葡萄品種選擇13 個莖段,分別經過上述2 個消毒處理過程。 消毒后的莖段,分別剪去新梢頂端和切口部位,以避免消毒劑對莖段的剪切口的影響。 以幼嫩的和半木質化的莖段為外植體,接種于MS+0.2 mg·L-1IBA +1.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1KT +4.0 mg·L-1腺嘌呤+30 g·L-1蔗糖+ 8.2 g·L-1瓊脂培養基上。 培養環境如下:光照強度為30～40 μmol·m-2·s-1,光照時間為14 h·d-1,培養溫度為25±2℃,15 d 后觀察莖段生長狀況,并統計萌芽率。

1.2.2 增殖與生根培養 單芽長度為5～6 cm 時,進行繼代培養。 剪成單芽莖段(長10 ～15 mm),每瓶接種3～4 個莖段。 設置不同成分配比的培養基(分別記作T1、T2、T3),以篩選適用于4 個鮮食葡萄品種增殖生根的培養基,培養基成分如下:T1 ∶1/2MS + 0.1 mg·L-1IBA +1.0 mg·L-1KT +30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂,pH 值5.8;T2 ∶1/2MS +0.2 mg·L-1IBA + 1.0 mg·L-1KT+30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂,pH 值5.8;T3:WPM +0.2 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂,pH 值5.8。 每個葡萄品種選擇經過啟動培養萌發的新芽(梢)≥10 個,接種在上述3 種培養基上,記為第1 代。 每45 d 繼代一次,記錄前3 代的繁殖體增殖系數和生根率。 繼代增殖系數是以每個莖段作為一個繁殖體,繼代一次可獲得多個用于繁殖下一代的莖段(繁殖體),上下兩代之間繁殖體數量之比值,取平均值。 生根率是統計每個繁殖體是否發生不定根,每代發生不定根的繁殖體數與總繁殖體數之比值,按百分率計算,取平均值。 培養環境:光照強度為30 ～40 μmol·m-2·s-1,光照時間為14 h·d-1,培養溫度為25±2℃。

1.2.3 馴化移栽 選擇繼代培養45 d 生長健壯的組培苗,水清洗根部殘留的培養基,放入裝有改良的霍格蘭德半營養液(霍格蘭德營養液的大量元素用量減半)的廣口瓶中,室內自然光下覆膜培養2 周,再用全霍格蘭德營養液練苗(去膜)1～2 周(去膜時注意觀察組培苗是否萎蔫,若2h 后仍不萎蔫則去膜培養),每周更換營養液。

水培煉苗結束后,移栽至營養缽(直徑6.5 cm)中,營養土和蛭石按1 ∶1(v ∶v)混合。 搭建小拱棚,保溫(25± 2℃)保濕(相對濕度100%),注意通風換氣。移栽后第4 周即可去掉覆蓋物[12]。 統計移栽后組培苗的成活率。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2013 進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 恒溫水浴處理時間對葡萄休眠枝條萌發的影響

45℃恒溫水浴處理葡萄休眠枝條,在約2 周開始萌發新芽,3 周后新芽長至10 ～15 cm 長度,可以作為無菌接種的外植體。 不同水浴處理時間,休眠枝條的萌芽率不同,其中以處理1.5 h 的萌芽率最高(97.62%),處理3 h 的萌芽率次之(95.12%),處理4 h 的萌芽率最低(86.21%)。 結果表明,45℃恒溫水浴處理1.5 h 可以有效打破葡萄枝條休眠。

2.2 不同濃度次氯酸鈉溶液消毒對葡萄外植體成活的影響

高濃度(3%)次氯酸鈉表面消毒處理,外植體在消毒后逐步出現紅褐化現象,有時褐化延展至新萌芽的腋芽,使莖段上的腋芽不能正常萌發(圖1-A);而減少消毒時間,外植體褐化程度有所降低,但污染率高,接種成活率低。 低濃度(0.3%～0.5%)次氯酸鈉進行較長時間消毒,外植體能夠保持正常綠色,幼嫩的莖段不出現褐化,外植體污染率低,且萌發的芽體生長良好(圖1-B)。 夏黑葡萄外植體在高濃度和低濃度次氯酸鈉消毒處理的接種成活率分別60.0%和100.0%,紅地球分別為50.0%和88.7%,巨峰分別為57.1%和87.5%,玫瑰香分別為52.0%和93.9%。 結果表明,低濃度次氯酸鈉消毒效果好。

2.3 不同培養基對葡萄莖段增殖生根培養的影響

圖1 不同濃度次氯酸鈉消毒處理對夏黑葡萄外植體接種成活的影響Fig.1 Effect of different concentrations of sodium hypochlorite on survival of Summer Black grape explants

圖2 4 個葡萄品種在不同培養基上的生長狀態(40 d)Fig.2 Growth status of plantlets of four table grape cultivars on different mediums for 40 days

增殖生根培養過程中,3 種培養基均能促進葡萄莖段腋芽萌發和生長,但長勢存在差異。 由圖2、圖3可知,T1 和T2 培養基中,葡萄莖段上的腋芽萌發率低、新梢生長瘦弱、葉片皺縮下垂、培養后期易出現玻璃化和褐化現象,不定根發生量少,且生長不良,不利于葡萄組培苗的擴繁;T3 培養基中的莖段腋芽萌發率高、新梢生長健壯、繼代增殖系數相對較高,根系生長正常,不定根生長良好,側根數量多。 繼代40 d 后,隨機選取T3 培養基上培養的9 株生長健壯、生根良好的組培苗,統計葉片數、平均株高、主根數量及平均根長。由表1 可知,夏黑和巨峰生根情況相對較好,紅地球和玫瑰香植株長勢相對良好,紅地球的生根率相對較低。結果表明,T3 培養基為最佳培養基。

圖3 4 個葡萄品種在不同培養基上的不定根生長狀態(40 d)Fig.3 Growth status of adventitious roots of four table grape cultivars on different mediums for 40 days

表1 4 個葡萄品種在T3 培養基上的繼代培養Table 1 Subculture of plantlets of four grape cultivars on T3 medium

2.4 4 個鮮食葡萄馴化移栽情況

選取繼代45 d 后的組培苗,水清洗根部殘留的培養基,半營養液水培煉苗2 周后,生長健壯,根系生長良好(圖4)。 利用全營養液繼續培養1 周后移栽至溫室內,4 周后統計移栽成活率,4 個品種的成活率均達100%(表2)。 結果表明,水培馴化適用于4 個鮮食葡萄品種,能有效的提高移栽成活率。

3 討論

本試驗通過對無菌外植體建立、啟動培養、增殖培養和馴化移栽4 個關鍵技術的研究,建立了鮮食葡萄組培快繁體系。 將田間采集的冬季休眠葡萄枝條放入45℃恒溫水浴處理1.5 h,可有效打破枝條休眠,低于1.5 h 處理效果還有待進一步探究。 選用葡萄長新梢(10 cm)、半木質化莖段為外植體,低濃度(0.3%～0.5%)次氯酸鈉溶液長時間消毒,接種培養污染率較低,外植體萌芽率較高,盡管以升汞作消毒劑的污染率和褐化率均較低,但升汞具有毒性,對研究人員的身體健康有一定影響,而次氯酸鈉溶液無毒,是葡萄組培的理想消毒方式[21-22]。 長新梢作為外植體消毒,傷口面少,消毒后再剪短莖段接種,可以減少褐化,有利于誘導腋芽萌發[9]。

培養基的成分對葡萄組培苗增殖和生根影響顯著。 本研究中,添加0.2 mg·L-1IBA 的WPM 培養基中4 個葡萄品種的莖段增殖和生根效果均較好,而在1/2MS 培養基中,組培苗長勢弱、生根較困難,這與前人研究[15-16,23]結果不同,可能與培養基中物質成分的種類(如鹽離子、有機成分、激素等)、含量不同或品種基因型有關。 與1/2MS 培養基相比,WPM 培養基中不含銨態氮、硝態氮含量降低、鈣離子含量增加,更適合葡萄組培苗的擴增。 植物組織培養繼代過程中,可以通過腋芽產生不定芽(叢生芽)和腋芽萌發成新梢2種方式擴繁,生長素類物質在2 種方式中均是必需的,而細胞分裂素類物質在促發叢生芽的方式中是必需的[24-25],但在腋芽萌發成新梢的中不是必需的[8-9];生長素類物質與細胞分類素類物質濃度比例高,可以促進生根[26]。 本研究中,4 個鮮食葡萄品種以腋芽萌發成新梢的方式進行擴繁,不產生叢生芽,繼代增殖系數相對較低[27-28],但新梢生長與生根同時進行,組培苗生長健壯,多次繼代培養后無玻璃、褐化現象,同時簡化了操作步驟。 紅地球生根率相對較低,盡管隨著繼代次數的增多,生根率有所提高,但仍不及其他3 個品種,這可能與培養基成分、激素種類和比例不同有關[29],可通過調整生長素類物質和細胞分裂素類物質的種類及比例做進一步優化。

馴化移栽過程中,選擇長勢良好、根系發達的組培苗,水培煉苗3 周后移栽在適宜的環境條件中,4 個品種組培苗的移栽成活率均達到100%,較傳統方法有明顯提高[6,10]。 水培馴化使用的營養液中含有大量元素和微量元素,有利于組培苗的生長,提高組培苗的光合能力、根系吸水能力和環境適應能力,進而提高移栽成活率[20]。 該方法應用于葡萄苗木生產中可有效提高苗木生產速率。 葡萄組培苗水培馴化期間可能存在葉片長霉菌的現象,當發生此現象時應及時剪掉帶菌葉片,以免影響該植株及其周圍植株的生長;馴化時間可以根據組培苗的生長狀態進行調整,植株根系發達且在去膜條件下也可正常生長,即可進行移栽。

4 結論

本研究建立了4 個鮮食葡萄品種組培快繁體系。以冬眠枝條恒溫水浴1.5 h 促發萌芽效果最好;最佳消毒方式為0.3%～0.5%次氯酸鈉消毒15 min;適宜的啟動培養基為MS+0.2 mg·L-1IBA + 1.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1KT +4.0 mg·L-1腺嘌呤+30 g·L-1蔗糖+8.2 g·L-1瓊脂;采用只添加0.2 mg·L-1IBA 的WPM培養基作為繼代增殖兼生根培養基,有利于莖段上腋芽的萌發與根系的生長,但增殖系數相對較低,且紅地球生根率較低;水培馴化為有效的馴化方式,有利于大規模生產。 整個組培繁殖體系基本適用于4 個鮮食葡萄品種的繁育,為其商業化生產提供了理論參考。