褐色雙孢蘑菇原生質體制備、再生條件的研究

王金斌 李 文 蔣 瑋 白 藍 劉 華李正鵬 吳文惠 唐雪明,,?

(1上海市農業科學院/上海市農業遺傳育種重點實驗室,上海 201106;2上海海洋大學食品學院,上海 201306)

褐色雙孢蘑菇(Agaricus bisporus Protobello)的菇蓋為棕褐色,菌肉和菇柄呈白色,是商業化菌株白色雙孢蘑菇的一個變種,國內俗稱牛排菇,棕秀一號是國內選育認定的商業化栽培的褐色蘑菇菌株,其味道鮮美,貨架期長,適溫廣,且低溫結實能力強,抗逆,不易褐變[1]。雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)栽培起源于法國,至今已有460 多年的歷史,雙孢蘑菇菌種的提純、制備與改良也有100 多年歷史[2]。 雙孢蘑菇的育種方法和技術主要包括自然選種、純種培養、組織分離保種、多孢分離育種[3]、單孢分離育種[4-5]和雜交育種[6-7]等。 但雙孢蘑菇遺傳背景復雜,缺少優良性狀和穩定遺傳的生物學標記,且擔子上的兩個孢子大多是自身可育的異核,其與不能結實的同核體間沒有鎖狀聯合的形態差異,限制了雙孢蘑菇的常規雜交育種工作,導致雙孢蘑菇改良菌株的進程緩慢[8-11]。 目前,世界各國使用的雙孢蘑菇商業菌種來源于國外雜交品種U 系列或國內AS2796 系列的后代,如A15、W192 等工廠化栽培菌株[2]。

隨著雙孢蘑菇選育種技術發展到基因工程水平。Morin 等[12]2012年完成了雙孢菇A. bisporus var.bisporusH97 ( 雙 孢 變 種) 和 A. bisporus var.burnettiiJB137-S8(四孢變種)2 個變種的全基因組序列測定,并構建了全基因組框架圖,為雙孢蘑菇的分子遺傳學研究和功能基因組研究打開了大門。 建立良好穩定的原生質體制備技術是雙孢蘑菇的分子遺傳學操作的關鍵步驟之一[13]。 原生質體再生[14-15]、誘變[16-17]、融合育種[18-19]、原生質體轉化育種[20-21]、原生質體基因組重排[22-23]以及基因組定向編輯技術[24]都必須以高產量和高再生率的原生質體為前提,所以優化原生質體制備和再生條件顯得尤為必要[25]。

近年來,白色雙孢蘑菇原生質體的制備已成為研究熱點,供試菌株包括As2796、浙農1 號、雙孢蘑菇765 號等[26-29]。 綜合前人在白色雙孢蘑菇原生質體制備的相關研究,本試驗以褐色雙孢蘑菇棕秀一號為材料,在前期獲得最佳褐色雙孢蘑菇原生質體再生溫度、滲透壓穩定劑和再生培養基的基礎上,對影響褐色雙孢蘑菇原生質體制備和再生的菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時間、酶解溫度等5 個關鍵因素進行優化,通過響應面法確定褐色雙孢蘑菇原生質體產量和再生率的最佳條件,初步利用紫外線和甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)對褐色雙孢蘑菇原生質體進行誘變處理,以期選育出基質利用率高的褐色雙孢蘑菇菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試褐色雙孢蘑菇棕秀一號菌株,由上海市農業科學院食用菌研究所菌種保藏中心提供。

1.2 主要試劑

溶壁酶(lywallzyme),購自廣東微生物研究所;蝸牛酶(snailase),購自上海源葉生物科技有限公司;甘露醇,購自北京鼎國生物技術中心;甲基磺酸乙酯,購自美國Sigma 公司。

1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養基(1 L):無霉菌新鮮稻草100 g,煮沸30 min 后用雙層紗布過濾,濾液定容到1 L,即為稻草浸汁[28];馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養基配置:用稻草浸汁代替水,新鮮馬鈴薯塊200 g、葡萄糖20 g,按照馬鈴薯葡萄糖瓊脂[potato dextrose agar(medium),PDA]培養基配制方法配制;再生培養基(1 L):新鮮馬鈴薯塊200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g,甘露醇終濃度為0.6 mol·L-1。 上述培養基均采用濕熱滅菌法滅菌,然后置于4℃下保存備用。

1.4 褐色雙孢蘑菇菌絲的培養

取適量PDA 培養基上生長的菌絲(菌齡7 d),接種到裝有100 mL 液體馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養基的三角瓶中,25℃恒溫培養7 d,每12 h 搖勻一次,收集菌絲。 用ULTRA-TURRAX 無菌均質器(上海旦鼎國際貿易有限公司)將菌絲拍打粉碎,然后吸取1 mL菌液至100 mL 液體馬鈴薯葡萄糖稻草浸汁培養基中,25℃條件下恒溫培養5～10 d。

1.5 褐色雙孢蘑菇原生質體的制備

取培養5～10 d 的褐色雙孢蘑菇菌絲,先用4 層滅菌的紗布過濾,然后用無菌水沖洗3 次,用無菌紙吸干后懸浮于適量的一定濃度的等體積雙酶溶液(0.5%～2.5%溶壁酶,1%～9%蝸牛酶)中,25 ～33℃、100 r·min-1振蕩酶解6～10 h 后,用G3 的砂芯漏斗過濾以除去菌絲碎屑,然后4℃條件下4 000 r·min-1離心10 min,收集原生質體并用0.6 mol·L-1甘露醇滲透壓穩定劑洗滌3 次,最后加入適量0.6 mol·L-1甘露醇滲透壓穩定劑制成懸浮液,用血球計數板計數。 每個處理設3 個重復。

1.6 褐色雙孢蘑菇原生質體的再生

將制備好的原生質體懸液稀釋至濃度5×103個·mL-1,然后取100 μL 涂布于再生培養基上,25℃恒溫培養7～11 d 觀察再生情況并計算再生率,以無菌水作低滲處理原生質體為再生對照。 以上每個處理設5 個重復。 按照公式計算再生率[30-31]:

再生率=(再生培養基上長出的菌落數-低滲處理后再生培養基上長出的菌落數)/涂布原生質體數×100%。

1.7 單因素試驗設計

在原生質體制備過程中,分別考察菌齡(5 ～9 d)、溶壁酶濃度(1%～5%)、蝸牛酶濃度(1%～9%)、酶解時間(1～5 h)、酶解溫度(25 ～33℃)對原生質體產量及再生率的影響。

1.8 響應面試驗設計

根據響應面Box-Behnken 設計原理[32-33],在單因素試驗的基礎上,以菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時間、酶解溫度5 個因素為自變量,以原生質體產量及再生率為響應值,進行五因素三水平的響應面分析試驗。 響應面試驗設計與水平因素見表1。

表1 響應面試驗設計與因素水平表Table 1 Design and levels of response surface experiment

1.9 褐色雙孢蘑菇原生質體誘變效應的初探

在褐色雙孢蘑菇原生質體制備和再生的最佳條件的基礎上,根據菌種誘變處理后致死率在70%～80%時正突變效果最佳,用紫外線(15 W 紫外燈,培養皿距紫外燈管30 cm,照射時間45 s)或1%EMS(在25±0.5℃條件下處理1 h)處理褐色雙孢蘑菇原生質體,以在PDA 培養基上恒溫(25℃)培養5 d 的原生質體生長直徑為指標,篩選生長性能改進的褐色雙孢蘑菇菌株。

1.10 數據分析

采用Design Expert V8.0.6 軟件對響應面試驗設計方案及結果進行分析,數據以獨立樣品測定結果的平均值表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 菌齡對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響 由圖1 可知,隨著菌絲菌齡的延長,制備的原生質體產量及再生率先增加后降低,呈正態分布。 當菌絲菌齡為7 d 時,制備的原生質體產量及再生率最高。因此,將6～8 d 作為菌絲的較適菌齡。

圖1 菌齡對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響Fig.1 Effect of mycelial age on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.1.2 溶壁酶濃度對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響 由圖2 可知,不同濃度的溶壁酶酶解獲得的原生質體產量和再生率是不同的,溶壁酶濃度為1.5%時,原生質體的產量最高;溶壁酶濃度為2%時,原生質體的再生率最高。 綜上,選擇1%～2%作為溶壁酶的較適濃度。

2.1.3 蝸牛酶濃度對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響 由圖3 可知,蝸牛酶分離褐色雙孢蘑菇菌絲原生質體與溶壁酶的變化趨勢一致,蝸牛酶濃度過高或過低,原生質體的產量和再生率均下降。 不同濃度的蝸牛酶酶解均可獲得褐色雙孢蘑菇菌絲原生質體,但其產量和再生率有區別,故選擇5%～7%作為蝸牛酶的較適濃度。

圖2 溶壁酶濃度對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響Fig.2 Effect of lywallzyme enzyme concentration on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

圖3 蝸牛酶濃度對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響Fig.3 Effect of snaliase enzyme concentration on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.1.4 酶解時間對原生質體制備及再生的影響 由圖4 可知,隨著酶解時間的延長,褐色雙孢蘑菇菌絲原生質體產量及再生率先增加后逐步降低。 當酶解時間為3 h 時,原生質體產量及再生率達到最高。 因此,選擇2～4 h 作為較適酶解時間。

2.1.5 酶解溫度對原生質體制備及再生的影響 優化酶解溫度是為了獲得溶壁酶和蝸牛酶雙酶酶解的最適溫度,以提高褐色雙孢蘑菇原生質體產量及再生率。由圖5 可知,當酶解溫度為29℃時,褐色雙孢蘑菇菌絲原生質體產量及再生率最高。 酶解溫度過低或過高均會影響溶壁酶和蝸牛酶的酶活性,進而影響脫壁效果。果。 因此,選擇29～31℃作為較適酶解溫度。

圖4 酶解時間對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.2 響應面試驗設計與結果

圖5 酶解溫度對褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生的影響Fig.5 Effect of enzymolysistemperature on the preparation and regeneration of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

2.2.1 響應面試驗結果 以原生質體產量及再生率為響應值,考察菌齡、溶壁酶 濃度、蝸牛酶濃度、酶解時間、酶解溫度5 個因素及其交互作用對響應值的影響,共設計了五因素三水平的46 個試驗點。 響應面試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案與結果Table 2 Experimental design and results of response surface experiment

表2(續)

運用軟件Design Expert V8.0.6 分析響應面的回歸參數、數學擬合方程及方差分析,并對表1 中的數據進行多元回歸擬合分析,得到褐色雙孢蘑菇原生質體產量、再生率與各因素變量的二次多項回歸方程模型。

2.2.2 回歸方程的顯著性檢驗與方差分析 良好的擬合模型的建立為最優工藝條件的求解提供了先決條件[34]。 由表3 可知,回歸方程模型(1)達極顯著水平(P＜0.000 1),表明回歸方程模型(1)與實際情況具有很好的擬合度,能夠反映褐色雙孢蘑菇原生質體產量與各因素之間的關系;校正決定系數Radj2= 0.944 3,失擬項差異不顯著(P＞0.05),表明回歸方程模型(1)理論上能解釋5 個變量對響應值的影響達94.43%,其他影響因素對褐色雙孢蘑菇原生質體產量的影響較小,回歸方程模型(1)可以很好地反映實際值。 方差分析表明,二次回歸方程模型(1)可用于褐色雙孢蘑菇原生質體制備產量的分析與預測,試驗中5 個因素對褐色雙孢蘑菇原生質體產量的影響程度次序為溶壁酶濃度＞酶解溫度＞菌齡＞蝸牛酶濃度＞酶解時間。 回歸方程模型的結果表明,一次項A、B、E 與二次項A2、B2、C2、D2、E2差異性極顯著(P＜0.01),交互項AE 達到顯著水平(P＜0.05),表明A、E 對褐色雙孢蘑菇原生質體產量的影響具有交互作用,不是簡單的線性關系。

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析(因變量為原生質體產量)Table 3 Significance test and analysis of variance (ANOVA) of regression equation (protoplast yield as the dependent variable)

由表4 可知,回歸方程模型(2)差異達極顯著水平(P＜0.000 1),說明回歸方程模型(2)與實際情況擬合較好,能夠反映褐色雙孢蘑菇原生質體再生率與各因素之間的關系。 失擬項差異不顯著(P＞0.05),說明其他因素對試驗結果影響較小,適用于褐色雙孢蘑菇原生質體再生率與各因素變量的優化。 校正決定系數0.938 9,可解釋為回歸方程模型(2)有93.89%的響應值,僅有6.11%不能用模型(2)來解釋。 考察因素對褐色雙孢蘑菇原生質體再生率影響的次序為溶壁酶濃度＞酶解溫度＞菌齡＞蝸牛酶濃度＞酶解時間。交互作用中AE 的交互作用呈極顯著水平(P＜0.01)。

表4 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析(因變量為原生質體再生率)Table 4 Significance test and analysis of variance (ANOVA) of regression equation(Regeneration rate as the dependent variable)

2.2.3 各因素交互作用的響應面分析 響應面圖中曲面的陡峭程度表示變量對因變量(褐色雙孢蘑菇原生質體產量和再生率)的影響程度,曲面較平表明影響較小,反之曲面越陡則影響較大;等高線圖體現了5個考察因素之間交互影響的強弱,等高線為圓形表示交互作用不顯著,橢圓形則表示交互作用顯著[26]。 結合回歸方程(1)、(2)及表3 ～4 可知,二次項AE 具有極顯著的交互作用(P＜0.001),即菌齡與酶解溫度2個因素間交互作用顯著,圖6、圖7 也驗證了這一結果。

2.2.4 試驗結果的驗證 通過Design Expert V8.0.6響應曲面法分析試驗結果,確定最佳褐色雙孢蘑菇原生質體產量的原生質體制備工藝條件為菌齡8.36 d、溶壁酶酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時間3.00 h、酶解溫度30.45℃,此條件下由回歸方程(1)得出的褐色雙孢蘑菇原生質體產量理論值為4.37×107個·mL-1。 考慮到實際操作,將原生質體最佳制備工藝條件調整為:菌齡8.36 d、溶壁酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時間3.00 h、酶解溫度30.4℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質體的平均產量為4.39×107個·mL-1,與理論值偏差不大,說明回歸方程模型(1)可用于實際預測。

圖6 各因素交互作用對褐色雙孢蘑菇原生質體產量影響的響應面圖Fig.6 Response surface graphs of the effects of various factors and their interaction on the yield of Agaricus bisporus Portobello protoplasts

顯微觀察優化條件下制備的褐色雙孢蘑菇原生質體。 由圖8 可知,原生質體個體較大、形狀圓潤,說明原生質體活性較好,保證了其再生率。

圖7 各因素交互作用對褐色雙孢蘑菇原生質體再生率影響的響應面圖Fig.7 Response surface graphs of the effects of various factors and their interaction on the yield of Agaricus bisporus Protobella protoplasts

經軟件分析得出最佳褐色雙孢蘑菇原生質體再生率的原生質體制備工藝為菌齡9.00 d、溶壁酶酶濃度1.32%、蝸牛酶酶濃度6.96%、酶解時間2.97 h、酶解溫度31.00℃,此條件下由回歸方程(2)得出的褐色雙孢蘑菇原生質體再生率的理論值為14.53%。 此條件下對褐色雙孢蘑菇原生質體制備進行5 次平行制備實驗,褐色雙孢蘑菇原生質體的實際平均再生率為15.10%,與理論值偏差不大,說明回歸方程模型(2)可應用于實際預測。

2.3 誘變后生長性能的篩選

以褐色雙孢蘑菇棕秀一號為研究材料,分別在原生質體制備產量優化和再生率優化條件下,經過紫外線和EMS 誘變后,并進行褐色雙孢蘑菇原生質體的再生,以平板生長性能為篩選指標,初篩選育出18 株生長性能提高的褐色雙孢蘑菇菌株。 圖6 中圓圈所示即為篩選得到的5 株生長速率提高的突變菌株。

圖9 褐色雙孢蘑菇生長性能提高菌株的篩選Fig.9 Screening of improved growth performance strains of Agaricus bisporus Portobello

3 討論

原生質體的制備與再生是兩個相互聯系的過程,通常原生質體產量較高時,再生率也較高,但過度酶解會導致原生質體損壞或破裂,不利于原生質體的再生[33]。 獲得原生質體的高產量和提高原生質體的再生率是影響原生質體后續育種操作成功的關鍵因素。本研究采用單因素試驗和Box-Behnken 響應面法,考察菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時間、酶解溫度5 個因素對褐色雙孢蘑菇原生質體產量及再生率的影響,結果表明,菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時間、酶解溫度等5 個因素的一次項、二次項、交互項AE均對原生質體的制備具有顯著影響,其中菌齡對原生質體制備影響最大。 菌齡會影響菌體生理狀態,如細胞壁的結構、菌體的代謝水平與菌體的活力。 為使褐色雙孢蘑菇的菌絲體有利于制備原生質體及原生質體的再生,本試驗通過優化菌齡,使其菌體細胞更易于原生質體化。 菌體對溶壁酶、蝸牛酶最敏感,若褐色雙孢蘑菇的菌絲體菌齡過短,制備的原生質體易破裂;菌齡過長,菌絲則老化,對溶壁酶和蝸牛酶敏感度降低,酶解效果差,且菌絲的活力也降低,從而褐色雙孢蘑菇原生質體的得率及再生率降低。 酶解時間對褐色雙孢蘑菇原生質體再生影響最大,原生質體上未酶解完全的殘留細胞壁,有利于原生質體細胞壁再生。 當酶解時間過長,會失去再生的細胞殘壁引物而難于再生,溶壁酶和蝸牛酶酶解體系中雜酶或雜質(過氧化物酶、核糖核酸酶)也會對原生質體造成損害,致使原生質體活性越低,甚至變形破裂[30]。

本研究結果表明,回歸模型(1)和(2)方差分析達到極顯著水平,且失擬項不顯著,表明回歸方程模型(1)和(2)對實際試驗擬合效果好。 通過驗證試驗,最終確定最佳褐色雙孢蘑菇原生質體產量的原生質體制備工藝為菌齡8.36 d、溶壁酶酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時間3.00 h、酶解溫度30.4℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質體平均產量為4.39×107個·mL-1,較王波等[27]原生質體制備條件提高了854.3%;確定最佳褐色雙孢蘑菇原生質體再生率的原生質體制備工藝為菌齡9.00 d、溶壁酶酶濃度1.32%、蝸牛酶酶濃度6.96%、酶解時間2.97 h、酶解溫度31.0℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質體的平均再生率為15.1%,較王波等[27]優化的原生質體再生率提高了157.2%。

不同誘變劑的誘變機理不同,因此不同誘變方法可以構建具有一定基因型多樣性的褐色雙孢蘑菇陽性突變庫。 本研究通過優化的褐色雙孢蘑菇原生質體制備及再生條件,利用化學誘變和物理場誘變的方法對褐色雙孢蘑菇的生長性能進行了初篩,選育出18 株生長性能提高的褐色雙孢蘑菇菌株,為構建豐富的基因型陽性正向突變褐色雙孢蘑菇菌株庫提供了技術支撐。 與直接對擔孢子進行誘變[35]相比,以原生質體作為誘變材料,由于其沒有細胞壁,對誘變劑更加敏感,能提高突變率,更有利于篩選目的菌株。 此外,該方法簡便,效果較好,是選育生長性能優良的褐色雙孢蘑菇菌種的有效方法。

4 結論

真菌微生物細胞細胞壁的存在,限制了褐色雙孢蘑菇誘變育種、細胞融合和分子育種技術的應用和效率。 本研究在單因素試驗的基礎上,采用Box-Behnken響應面法系統性優化,建立了雙酶酶解制備褐色雙孢蘑菇原生質體工藝參數的二次多項式回歸模型,經驗證該模型合理可靠,能準確地反映褐色雙孢蘑菇原生質體產量和再生率。 菌齡、溶壁酶濃度、蝸牛酶濃度、酶解時間、酶解溫度5 個因素對褐色雙孢蘑菇原生質體產量和再生率有顯著影響,最佳褐色雙孢蘑菇原生質體產量的原生質體制備工藝為菌齡8.36 d、溶壁酶酶濃度1.35%、蝸牛酶酶濃度7.01%、酶解時間3.00 h、酶解溫度30.4℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質體平均產量為4.39×107個·mL-1;最佳褐色雙孢蘑菇原生質體再生率的原生質體制備工藝為菌齡9.00 d、溶壁酶酶濃度1.32%、蝸牛酶酶濃度6.96%、酶解時間2.97 h、酶解溫度31.0℃,此條件下褐色雙孢蘑菇原生質體的平均再生率為15.1%。 本研究結果為以褐色雙孢蘑菇原生質體進行遺傳轉化、基因組重排、基因編輯技術的后續分子試驗的科學研究奠定了理論基礎。