中國CBAVD 患者CFTR 基因內含子10-11(TAAA)n 短串聯重復序列檢測及意義

白 松 吳 斌

中國醫科大學附屬盛京醫院 泌尿外科（遼寧沈陽 110004）

前 言

囊性纖維化跨膜轉導子基因 （cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR，OMIM602421，基因突變可以導致先天性雙側輸精管缺如（congenital bilateral absence of the vas deferens，CBAVD，OMIM 277180）的發生，在白種人中78%的CBAVD 患者至少有一種CFTR 基因變異類型， 其中46%同時存在兩種變異類型。 白種人中約98%～99%的CBAVD 患者同時合并囊性纖維化（cystic fibrosis,CF,OMIM219700），而我國絕大部分為單獨發病，不合并囊性纖維化。

CFTR 基因突變會導致細胞膜氯離子通道功能障礙，無法調節氯離子和水分子的流通，由此導致生殖道產生的黏稠狀分泌物無法排除， 在胚胎期間即會導致輸精管梗阻和變性，由此可能導致CBAVD 的發生[1]。

關于我國CBAVD 患者CFTR 基因變異的研究非常有限，已有的研究表明，在黃種人群中外顯子突變率較低，且絕大多數突變頻率小于0.1%，分布也與白種人完全不同[2]。 這說明CFTR 基因外顯子突變具有明顯的種族特異性，而且其非編碼區可能存在導致CBAVD 疾病發生的變異，而這些變異類型不會導致CF 的發生。

短串聯序列廣泛的分布于基因組非編碼區， 其重復片段的長短與疾病的發生密切相關。 同樣在CFTR基因非編碼區內， 存在大量的二聚體和四聚體短串聯序列， 其通過與啟動子相互作用調節轉錄而影響基因的表達。 (TAAA)n 微衛星片段是位于內含子10-11 中的由4 個堿基組成的重復序列， 雖然不像內含子9-10中的Tn 那樣會影響第10 號外顯子mRNA 的剪接，造成第10 外顯子被漏轉錄，但是Estelle 等[3]的研究表明：IVS10-11(TAAA)n 短串聯序列可以與FOXI1 轉錄因子結合，負向調節CFTR 基因的表達，當其重復數量減少時與FOXI1 轉錄因子結合力增加， 從而影響CFTR 基因的轉錄。 尤其當其與啟動子c.-165G＞A 的輕微突變或與IVS9-10 （TG）mTn 相組合時， 可以導致CBAVD的發生， 是非常重要的順式作用原件，IVS10-11(TAAA)n 短串聯序列及其與啟動子c.-165G＞A 變異的情況在中國人群中未見相關研究。 本研究旨在探索中國CBAVD 患者CFTR 基因IVS10-11 (TAAA)n 及啟動子c.-165G＞A 的分布情況及其意義。

材料與方法

一、標本收集

2008 年8 月至2014 年1 月在本院就診的66 名CBAVD 患者為實驗組及60 名因女方因素于我院行輔助生殖的健康男性為對照組； 本實驗經過本院倫理委員會批準，所有入組患者均簽署知情同意書。

CBAVD 患者納入標準[4]：（1）兩名專科醫師同時查體，觸診雙側精索未觸及輸精管，睪丸大小正常（Prader 睪丸模型＞12mL）；（2）無囊性纖維化其他癥狀，排除慢性胰腺炎和慢性阻塞性肺疾病等；（3）精液分析檢查至少3 次，無精子，射精后尿液沉淀后也未見精子（除外逆行射精）， 精液量＜1.5mL，pH＜6.4， 精漿果糖＜13umol/mL 和ɑ-糖苷酶＜20μmol/mL；（4）超聲提示附睪頭飽滿，呈網格狀，可以伴有附睪尾以及精囊萎縮或缺如；（5）性激素水平正常；（6）染色體正常；（7）經皮睪丸穿刺取出精子行ICSI 輔助生殖；（8）無明確家族遺傳疾病。

生育力正常男性對照組納入標準：（1） 女方因素行ART；（2）精液分析正常；（3）性激素正常；（4）染色體正常。

二、外周血樣本采集和DNA 提取

抽取外周血4～6mL，EDTA 抗凝后，-20℃保存。 采用AxyPrep 全血基因組DNA 提取試劑盒 （Axygen 公司，美國）提取DNA，DNA 試劑盒成分包括：BufferAP1（細胞裂解液）30mL，BufferAP2 （蛋白沉淀液）6 mL，Buffer W1A concentrate （洗滌液）24mL，Buffer W2 concentrate（去鹽液）24mL，Buffer TE（洗脫液）11mL。 DNA提取操作步驟： 加500μLBuffer AP1 細胞裂解液到1.5mL 離心管中； 加200μLEDTA 抗凝全血到Buffer AP1 中，渦旋振蕩10s；加100μLBuffer AP2 蛋白沉淀液渦旋振蕩10s，然后12 000×g離心10min；將制備管放入2mL 離心管中，將上述離心后的上清加入制備管中，然后12 000×g離心10min；棄濾液，加入700μL Buffer W1A concentrate 洗滌液，室溫放置2min，然后12 000×g離心30s；棄濾液，加入800uL Buffer W2 concentrate 去鹽液，室溫放置2min，然后12 000×g離心1min；棄濾液，將制備管至于新的1.5mL 離心管中，在中央懸滴加100μl Buffer TE 洗脫液，室溫放置1min，然后12,000×g離心1min，離心管內即為DNA；使用UV 紫外分光光度計檢測標本濃度及純度，OD260nm/OD280nm 位于1.8～2.0 之間，否則重新提取，最后-80℃保存。

三、CFTR 基因內含子10-11 (TAAA)n 熒光FAM標記引物，PCR 擴增及PCR 產物毛細管電泳法檢測STR 分子標記

根據Ensembl 網站的CFTR 基因序列(http://asia.ensembl.org/index.html) 使用Primer 5.0 軟件設計引物，由ncbi-blast 驗證特異性， 委托北京博奧生物有限公司合成引物， 引物信息為正鏈(5'to3')GGAGGCTGAGGCAGGAGAA， 反鏈(5'to3')AGAAAAGCTGAAAGTCAAAAGG，5’ 端-FAM 標記，PCR 產物大小約360bp左右。

PCR 反應體系： 共計25μl， 包括水19.8μl，Taq Buffer 2.5μl，dNTP 10mM 0.5μl， 引物f 0.5μl， 引物R 0.5μl，Taq 酶5U/μl 0.2μl，模板1μl。 PCR 反應條件：預變性95℃3min，變性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s，循環數30 循環，修復延伸72℃6min。 PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨機挑4 個樣本PCR 產物檢測，確定擴增產物 （2%瓊脂糖凝膠電泳， 參數設置150V，100mA，20min）。

熒光標記的PCR 產物檢測：取96 孔反應板，標明板名、實驗日期，制作電子版檢測表，并自動生成上機表；使用連續加樣器，吸取990μl HIDI 和10μl LIZ500的混合物，加入到96 孔反應板中，每孔10μl；將96 孔板置于平板離心機中，離心500g 即停；使用12 排10μl排槍，對照檢測表，在96 孔板對應的孔中加入50pg 的樣品；將96 孔板置于平板離心機中，離心500×g即停；使用封板膜密封96 孔板，振蕩，將96 孔板置于平板離心機中， 離心500×g即停， 置于PCR 儀； 變性程序為98℃5min，程序結束后立即將96 孔板置于冰水混合物上急速冷卻，再置于平板離心機中，離心2000×g即停；使用ABI 3730xl 測序儀檢測STR 樣本。 選取標準樣本，根據測序結果對樣本定標，使用Genemapper 軟件分析STR 數據，橫坐標為片段大小，縱坐標為熒光強度值，根據片段大小來判斷結果。

四、CFTR 基因ATG 轉錄起始前1.4kb 啟動子測序

根據Ensembl 數據庫CFTR 基因啟動子序列（http://asia.ensembl.org/index.html）， 使用primer premiere 5.0設計引物，ncbi-blast 驗證特異性， 由TaKaRa Biotechnology(大連，中國)合成，PCR 引物序列5'-TCACAAGACCCTTGCCTTAG-3' (forward) and 5'-GCCTTTTCC AGAGGCGACCT-3' (reverse). 擴增產物片段大小為1402 bp，使用1%瓊脂糖凝膠（TaKaRa 公司，日本）電泳確認該引物合成DNA 片段的特異性。

PCR 試劑（TaKaRa 公司，日本），總反應體系20μl，包括DNA 樣品0.5μL，10×Ex Taq buffer 2.0μL，2.5mmol dNTP Mix 1.6μl，Primer 10.8μL，Primer 20.8μL，5u Ex Taq 0.2μL，ddH2O 14.1μL。

PCR 反應條件：初始變性95℃，5 分鐘；變性95℃，30s； 退火58℃,30s； 延伸72℃，40s； 終末延伸72℃，10min； 共計30 個PCR 循環。 純化擴增產物后使用ABI 7500 Sequence Detection System 測序儀測序。

五、生物學信息來源和分析軟件

基因組數據庫：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen ome/guide/human；http://www.ensembl.org； 引物設計軟件：Primer 5.0；基因比對：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat；基因序列分析軟件：Chromas1.6。

六、數據統計分析

使用SPSS22.0 軟件進行統計學分析， 計數資料使用χ2檢驗，Fisher's exact test 和非條件logistic 回歸，P＜0.05 認為有意義。

結 果

一、CFTR IVS10-11(TAAA)n，熒光FAM 標記引物PCR 毛細管電泳法檢測結果

在CBAVD 患者中IVS10-11(TAAA)n基因型分布有6 種，分別為(TAAA)9/(TAAA)9、(TAAA)9/(TAAA)10、

(TAAA)9/ (TAAA)11、 (TAAA)9/ (TAAA)12、 (TAAA)10/(TAAA)10和(TAAA)10/(TAAA)11，分別所占的百分比為：21.21%、50.00%、9.09%、3.03%、12.12%和4.55%；以(TAAA)9/(TAAA)10基因型為主（50.00%）；正常人群則僅有(TAAA)9/(TAAA)9和(TAAA)9/(TAAA)10兩種基因型，分別所占的百分比為：78.33%和21.67%，以(TAAA)9/(TAAA)9為主(78.33%)，這與CBAVD 組明顯不同。 兩組之間有顯著的統計學差異（Fisher's exact test=45.903，P＜0.01），見圖1，表1。

CBAVD 組等位基因可見4 種類型，(TAAA)9、(TAAA)10、(TAAA)11和 (TAAA)12， 所 占 比 例 分 別 為52.27%、39.39%、6.82%和1.52%。 正常人群的對照組僅可見2 種等位基因(TAAA)9和(TAAA)10，所占比例分別為89.17%和10.83%， 兩組之間有顯著統計學差異（X2=60.589，P＜0.01），見圖1、表2。

表1 CFTR IVS10-11(TAAA)n 基因型分布情況

表2 CFTR IVS10-11(TAAA)n 等位基因型分布情況

二、IVS10-11(TAAA)n 基因型的相對危險度

非條件Logistics 回歸分析結果表明：(TAAA)9/(TAAA)10基因型患 CBAVD 的風險是(TAAA)9/(TAAA)9基因型的9.228 倍，見表3。

表3 CFTR IVS-9(TAAA)n 基因型的相對危險度

三、啟動子c.-165G＞A 變異結果

66 名CBAVD 患者均未發現CFTR 基因啟動子c.-165G＞A 變異，見圖2。

圖2 CFTR 基因c.-165G＞A 變異情況a:CFTR 基因啟動子1.4kb PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳結果；b:CFTR 基因c.-165G＞A 正常純合型

討 論

1989 年Riordan 等[5]首先克隆了CFTR 基因（OMIM 602421） 的cDNA 片段并鑒定了其產物CFTR 蛋白（OMIM 602421），該基因位于7q31.2，包含約250kb[6]。CFTR 基因有高度多態性，目前NCBI 公布的CFTR 基因有2009 種突變形式，絕大部分發生率低于0.01%，極少數變異類型超過1%[7]。 目前研究顯示78%的CBAVD 患者至少有一種CFTR 基因變異類型， 其中48%同時存在兩種變異類型， 大部分為溫和的點突變（IV/V 級），很少有基因缺失或重排出現，約＜1%[8]。 其突變頻率及熱點，因地域和種族不同而有差別很大，白種人CFTR 基因突變率明顯高于黃種人。

囊性纖維化（CF）在白種人中發病率約為1/2500，大約1/25 的人群為突變基因的攜帶者， 而在黃種人中CF 非常罕見， 發病率小于0.1/10 萬，CF 的男性患者中95%～99%存在CBAVD[9]，而在我國，絕大部分僅存在CBAVD， 不合并囊性纖維化。 白種人和黃種人的CBAVD 發病率相似，約為1/1000，是常染色體隱性遺傳疾病。 目前認為CBAVD 為囊性纖維化的一個輕度的臨床表現類型，定義為囊性纖維化相關疾病，可以單獨發病，也可以同時合并囊性纖維化[10]。 一般認為一個嚴重雜合突變聯合一個輕微雜合突變（88%）或者兩個輕微的雜合突變（12%）會導致CBAVD 的發生，而一個嚴重的純合突變（88%）或兩個嚴重的雜合突變（12%）會導致CF 的發生[11]。

白種人CBAVD 患者最常見的等位突變基因為p.F508del、IVS9-10 5T 和p.R117H， 出現的頻率分別為21%～33%、25%～44%和3%[12,13]最常見的基因型為p.F508del/IVS9-10 5T 和p.F508del/p.R117H，頻率分別為28%和6%[4]。我國關于CBAVD 患者CFTR 基因突變的研究有限，外顯子突變率低約12.7%～37.0%，而且絕大多數突變頻率小于1%，分布也與白種人完全不同[2]。 這表明導致CBAVD 的CFTR 基因突變位點可能位于非編碼區。

短串聯序列廣泛的分布于基因組非編碼區，其重復片段的長短與疾病的發生密切相關，如II 型肌萎縮[18]及男性女乳[19]，既往的研究也證實位于啟動子及內含子[20,21]中的微衛星片段能夠影響基因轉錄。 同樣在CFTR 基因非編碼區內， 存在大量的二聚體和四聚體短串聯序列， 其通過與啟動子相互作用調節轉錄而影響基因的表達。 (TAAA)n微衛星片段是位于CFTR 基因內含子10～11 中的由4 個堿基組成的重復序列，雖然不像內含子9～10 中的Tn 那樣會影響第10 號外顯子mRNA 的剪接，造成第10 外顯子被漏轉錄，但是Estelle 等[3]的研究表明：FOXI1 轉錄因子可以與IVS10-11 (TAAA)n短串聯序列結合，負向調節CFTR 基因的表達，當其重復數量減少時與FOXI1 轉錄因子結合力增加， 從而影響CFTR 基因的轉錄。 原因可能為改變DNA 結構來影響其轉錄效率， 比如通過使DNA 結構彎曲或呈環狀后，會易化順式作用原件和反式作用因子之間的作用，尤其與c.-165G＞A 同時存在，致病風險更加增大。 FOXI1轉錄因子是由FOX 基因（winged helix/forkhead box）編碼的一組核蛋白，通過與DNA 內高度保守的forkhead順式作用元件結合， 廣泛參與組織和器官的分化和形成， 其具有明顯的組織特異性[22]。 最近的研究表明，FOXI1 對生精功能有重要作用，Blomqvist[23]將小鼠的FOXI1 基因敲除后，發現小鼠無法繁殖，另有研究也發現其對附睪成熟也具有重要作用[24]。

國外研究顯示正常白種人(TAAA)n 以9 為主，CF患者以11 為主， 并且一般與p.F508del 突變連鎖，CBAVD 患者也以9 為主，偶見6 和8[25,3]，目前沒有我國CBAVD 患者和正常人群的相關資料， 本研究結果表明我國人群與白種人不同，CBAVD 組等位基因可見4 種類型，(TAAA)9、(TAAA)10、(TAAA)11和(TAAA)12，所占比例分別為52.27%、39.39%、6.82%和1.52%。正常人群僅可見2 種等位基因(TAAA)9和(TAAA)10，所占比例分別為89.17%和10.83%，CBAVD 患者等位基因(TAAA)9頻率明顯低于正常人群， 兩組之間有顯著統計學差異（P＜0.01）。

我國CBVAD 患者基因型以(TAAA)9/(TAAA)10為主約占50.00%，(TAAA)9/(TAAA)9僅占21.21%；正常人群基因型則以(TAAA)9/(TAAA)9為主，約占78.33%，兩組之間有顯著的統計學差異（P＜0.01）；另外3 種等位基因型(TAAA)10、(TAAA)11和(TAAA)12均只出現在CBAVD 患者中，同時在我國CBAVD 患者和正常人群中均未見到(TAAA)6或(TAAA)8的等位基因類型。根據logistic 回歸分析我們發現(TAAA)9/(TAAA)10基因型患CBAVD 的風險是(TAAA)9/(TAAA)9基因型的9.22倍，如果出現(TAAA)10、(TAAA)11或(TAAA)12則患病風險會更高。這表明我國人群的CFTR 基因內含子10～11(TAAA)n分布完全不同于白種人， 而是有明顯的種族特異性， 隨著重復次數的增多，CBAVD 發病風險顯著升高。

另外Estelle 等[3]認為(TAAA)n與啟動子c.-165G＞A 突變有協同作用， 會引起CFTR 基因轉錄水平下降， 導致疾病發生。 而根據啟動子測序結果顯示我國CBAVD 患者中均未發現此種突變，說明我國CBAVD患者(TAAA)n變異與此啟動子突變無協同作用。

CFTR 基因IVS10-11 (TAAA)n的多態性與白種人不同， 我國CBVAD 患者基因型以(TAAA)9/(TAAA)10為主，正常人群基因型則以(TAAA)9/(TAAA)9為主。 同時也未發現IVS10-11(TAAA)n與啟動子c.-165G＞A 突變有協同作用。