麒麟丸對弱精子癥大鼠生殖系統的保護作用及調控機制探討Δ

劉勝京 郭博達 郭 軍 晏 斌 王 福 余國今 高慶和** 張繼偉

1. 北京中醫藥大學（北京 100029）；2. 中國中醫科學院西苑醫院男科（北京 100091）3.北京協和醫學院研究生院（北京 100730）；4.北京醫院泌尿外科（北京 100730）

弱精子癥指精液中前向運動精子比例低于32%或前向運動與非前向運動精子之和的比例低于40%的病癥，主要特征表現為精子的前向運動能力低下。目前西醫治療效果不甚理想，中醫藥治療弱精子癥歷史悠久，經驗豐富，具有獨到優勢[1，2]。麒麟丸是由制何首烏、墨旱蓮、淫羊藿、菟絲子等15 味中藥組成的上市中成藥，在治療弱精子癥方面的療效已在臨床中得到廣泛證實[3-6]。 本實驗采用奧硝唑所致弱精子癥大鼠模型，擬通過L-肉堿相關通路探討麒麟丸對生殖系統保護作用及其可能機制。

材 料

一、主要實驗藥物及試劑

麒麟丸（廣東太安堂藥業股份有限公司，批號：國藥準字Z10930034），左卡尼汀口服溶液（東北制藥集團沈陽第一制藥廠，批號：國藥準字H19990372），奧硝唑膠囊（西安萬隆制藥股份有限公司， 批號： 國藥準字H20031257），左旋肉堿標準品（上海源葉生物科技有限公司提供， 批號：JJ0731RA14），TRIZOL（10296028，Invitrogen），無水乙醇（10009218，國藥集團化學試劑有限公司），異丙醇（10009218，國藥集團化學試劑有限公司），DEPC （MD911875，MDL），UltraPure Agarose（165 00100，ABI-invitrogen），SuperScript III RT 逆 轉 錄kit（11752050，ABI-invitrogen），Sybr qpcr mix （4472920，ABI-invitrogen）。

二、實驗動物

SD 雄性大鼠，體質量（250±20）g，均由中國中醫科學院西苑醫院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（京）2018-00090， 共計40 只。 大鼠飼養于SPF 級環境中，均自由采食、飲水，室溫（25±2）℃，12h/12h 光暗周期。

三、主要儀器設備

Waters e2695 型高效液相色譜儀 （配備2998 型PDA 檢測器），熒光定量PCR 儀（StepOne Software，Applied biosystems），電子天平（十萬分之一，Mettler Toledo），臺式冷凍離心機（MIKRO 22R，Hettich），臺式高速冷凍離心機（Legend micro 21R，Thermo Fisher），光學顯微 鏡（DM3000，Leica），移液器（0.5～10 μL，2～20 μL，100～1000 μL，Eppendorf），渦旋混合儀（XW-80A，其林貝爾），分光光度計（Nanodrop lite，Thermo Fisher）。

方 法

一、造模并分組

適應性飼養1 周后， 將40 只雄性SD 大鼠隨機分為4 組，每組10 只，稱量后記錄體質量并進行編號。 根據文獻采用奧硝唑（ORN）所致的大鼠生殖功能損傷機制建立弱精子癥小鼠模型[7]。 通過預實驗選定ORN 灌胃劑量為400mg/（kg·d），連續灌胃28 d。 因ORN 水溶性差，故ORN 用0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC2Na）配制，均為每日新鮮配制。麒麟丸給藥劑量為1.62 g/(kg·d)，相當于麒麟丸產品說明書中每人每日口服劑量（18 g/d）。（具體分組見表1)。

表1 實驗分組

二、大鼠精液質量檢測

大鼠灌胃連續4 周，于末次給藥24h 后，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出實驗大鼠雙側附睪后稱量，取左側附睪尾，放入生理鹽水清洗后（37℃預熱），迅速放入M199 培養基（1 mL，37℃），剪開附睪尾使精子流出，放入培養箱（5%CO2，37℃），孵育3 min。孵育結束后吹打混勻，選取血細胞計數板進行人工計數。 血細胞計數板取5 μL 精子懸液加入到100 μL M199 培養基中，按照1∶20 的比例進行稀釋，吸取10 μL 稀釋后的精子懸液，滴于計數板蓋玻片的邊緣使精子懸液自動滲進計數池計數，并用計算機輔助精液分析系統（CASA）進行精子活力分級檢測。

三、高效液相色譜法測定附睪L-肉堿含量

采用高效液相色譜法測定附睪中的L- 肉堿含量。色譜條件為：色譜柱為Waters SunFireTMC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；檢測波長210 nm；柱前預處理，甲醇：0.3 g/L 十二烷基磺酸鈉 （SDS） 的磷酸緩沖液（pH2.4）=5：95， 以1.0 mL/min 的流速沖柱子40 min；流動相，甲醇：磷酸 緩沖 液（pH2.4）=20∶80，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。 取適量左旋肉堿對照品，精密稱定后，加入50%乙腈水溶液，制成每1 mL 含左旋肉堿1 mg 的溶液。

取上述對照品溶液，用50%乙腈水溶液逐級稀釋，得 濃度 為1000、500、250、125、62.5、31.25 mg/L 6 個 不同濃度的對照品溶液，并按上述色譜條件測定峰面積。以對照品溶液濃度（mg/L）為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線， 得回歸方程為Y=354 X + 726，r2=0.9997。表明左旋肉堿濃度在31.25～1000 mg/L 范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

四、RT-PCR 技術檢測附睪OCTN2 mRNA 表達

迅速從液氮中取出大鼠右側附睪頭、體、尾組織各400mg，加入Trizol（1 mL/100 mg）冰浴研磨，形成組織勻漿。 在組織勻漿中加入氯仿， 振蕩混勻， 靜置5min后，4℃12000×g離心10min， 取 上 清加 異 丙 醇 提 取RNA，棄上清，經75%乙醇洗滌后，溶于DEPC 水，獲得RNA 原液。 用紫外分光光度計檢測吸光度 （A 值），A260/A280 值為1.82，純度符合實驗要求。 按照superscript III （invitrogen） 試劑盒步驟進行RNA 反轉形成cDNA 第 一鏈。 用ABI 7900 qPCR 儀 按95℃、94℃、60℃、72℃，2min、20s、20s、30s 條件， 按表2 中引物序列，進行40cycle 擴增。

表2 引物序列

五、睪丸病理切片

取大鼠左側睪丸，進行稱量、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片操作后進行HE 染色，在光鏡下進行病理形態學觀察睪丸結構。

六、統計學處理

采用SPSS 20.0 進行單因素方差分析， 采用LSD進行組間比較。數據采用±s表示，以P＜0.05 為具有統計學意義。

結 果

一、精子濃度及總活力

由表3 可見，模型組與空白組相比，精子濃度差異無統計學意義（P＞0.05），精子總活力明顯下降（P＜0.01）。麒麟丸組和左卡尼汀組與模型組相比， 精子濃度差異無統計學意義（P＞0.05），精子總活力明顯上升（P＜0.05）。

表3 各組治療前后精子濃度及總活力比較（n=10，±s）

表3 各組治療前后精子濃度及總活力比較（n=10，±s）

注：與空白組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 精子濃度（106/mL） 總活力（%）空白組 37.29±11.41 60.25±8.02模型組 34.72±10.73 45.01±6.7**麒麟丸組 47.82±15.18 60.28±5.27#左卡尼汀組 46.95±5.68 58.44±5.47#

二、附睪肉堿含量

高效液相色譜法測定左旋肉堿出峰時間2.96 min，各組代表性圖譜見圖1，定量結果見表4。 與空白組比較，模型組肉堿含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，麒麟丸組和左卡尼汀組肉堿含量明顯增高（P＜0.01）。

圖1 各組附睪L-肉堿代表性圖譜

表4 各組附睪L-肉堿含量比較（n=10，±s）

表4 各組附睪L-肉堿含量比較（n=10，±s）

注： 與空白組比，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 左旋肉堿含量（mg/L）空白組 4091.2±176.2模型組 2990.2±179.5**麒麟丸組 8681.3±118.9##左卡尼汀組 7659.4±142.6##

三、OTCN2 RNA 的表達

與空白組組比較， 模型組OTCN2 mRNA 表達量無顯著差異(P＞0.05)；左卡尼汀組和麒麟丸組OTCN2 mRNA表達量高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖2。

圖2 干預后各組OTCN2 mRNA 表達情況比較

四、對睪丸組織病理的影響

用光學顯微鏡對HE 染色后的大鼠睪丸形態組織進行觀察，可見空白組的大鼠睪丸組織結構正常，生精小管形態正常，其管腔明顯，為正常類圓形，排列整齊緊密， 基底膜完整， 管腔內可見豐富的精子及精子細胞，層次清晰，各級細胞分裂活躍；間質細胞在小管間均勻分布。 模型組可見大量變性、萎縮等異常結構的不規則分布的生精小管， 可見狹小或部分完全閉合的管腔，管腔內精子及生精細胞數量少，排列不整齊，異常形態數量增多，各級生精細胞分裂不活躍；間質明顯減少，上皮細胞變薄并伴有脫落。 麒麟丸組和左卡尼汀組大鼠睪丸組織， 與模型組相比， 生精小管結構基本完整，管腔內生精細胞和精子細胞數量顯著增多，且分裂較為活躍，排列緊密；間質細胞分布較均勻，生精上皮細胞可見較為明顯恢復（圖3）。

圖3 光鏡下觀察各組大鼠睪丸組織結構變化（×200）

討 論

弱精子癥是導致男性不育的重要原因之一， 其病因復雜，與內分泌因素、生殖道感染、染色體異常、隱睪、精索靜脈曲張或全身性疾病等有關。 目前弱精子癥的機制研究主要涉及蛋白表達異常、能量代謝異常、線粒體功能以及信號轉導異常等[8，9]。

精子在睪丸中產生， 在附睪中精子成熟并獲得運動和受精能力。 而附睪內的L-肉堿（L-Carnitine），又稱左旋肉堿，在附睪中濃度最高，作為轉運脂肪酸進入線粒體的重要載體，具有啟動精子運動、促進精子成熟及提高精子受精能力的重要作用[10，11]。 目前，已經有多項多中心臨床試驗發現應用肉堿治療少弱精子癥可明顯提高精子的濃度及總活力[12-14]。 在男性生殖系統中, 肉堿的主要獲取方式是肉堿轉運蛋白通過主動轉運從血液中攝取。有機陽離子轉運子2（organic cation/carnitine transportor 2，OCTN2） 是附睪轉運肉堿的主要轉運蛋白，主要分布于附睪、腎臟、心臟等組織。 人類附睪可能依賴OCTN2 轉運肉堿進入附睪管, 為精子提供能量,促進精子成熟[15]。

中醫學無弱精子癥病名，一般將其歸納為精薄、精冷、難嗣等范疇，目前中醫藥認為在少弱精子癥中，腎精虧虛仍是主要病因[16]。 麒麟丸是補腎類中成藥的代表，具有補腎填精、益氣養血的作用。 本實驗主要基于L-肉堿通路， 對麒麟丸生殖系統保護作用及其可能機制進行探討。 實驗結果發現： 在精子濃度及總活力方面：與空白組相比，模型組精子濃度差異無統計學意義（P＞0.05），總活力明顯下降（P＜0.01）。 與模型組相比，麒麟丸組和左卡尼汀組精子濃度差異無統計學意義（P＞0.05），精子總活力明顯上升（P＜0.05）。 附睪L- 肉堿的含量方面：與空白組比較，模型組肉堿含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，麒麟丸組和左卡尼汀組肉堿含量明顯增高（P＜0.01）。 附睪OCTN2 mRNA 的表達方面：與空白組比較，模型組OTCN2 mRNA 表達量無顯著差異(P＞0.05)；左卡尼汀組與麒麟丸組OTCN2 mRNA 表達量高于模型組，差異有統計學意義(P＜0.01)。

綜上，本實驗發現，麒麟丸具有明顯提高奧硝唑造模致弱精子癥大鼠模型精子活力的作用， 其作用機制可能與其提高附睪L-肉堿的含量和OCTN2 mRNA 的表達有關，更詳細的作用機制有待進一步研究。