一種蛭弧菌微生態制劑對異育銀鯽養殖塘殺菌效果研究

張學師 ，張紀兵 ，袁圣 ，薛暉 ，趙彥華

（1.射陽縣水產技術推廣中心，江蘇 射陽 224300；2.南京智億生物技術有限公司，江蘇 南京 211100；3.江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300；4.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）是一類以裂解其他敏感革蘭氏陰性菌為主的小型寄生性細菌，其生活周期較獨特，能夠識別、侵入并定居宿主菌周質空間中，利用宿主細胞的營養進行絲狀生長，并裂解宿主細胞釋放子代蛭弧菌細胞，造成宿主細胞死亡[1]。蛭弧菌最早于1962年由Stolp等人首次發現，屬于原核生物界唯一一類周質性專性捕食性細菌[2]。研究表明，在水產養殖中，蛭弧菌具有能夠防治病害菌的潛力[3]，具有替代抗生素殺滅病害菌的應用價值[4]，且無法侵染真核細胞，對生物體無毒副作用[5]。鑒于蛭弧菌裂解宿主細胞的特性，加工成微生態制劑，在農業、工業和醫學等不同領域均顯示出廣闊的應用前景[6-7]。蛭弧菌的分離計數，與噬菌體相似，需要敏感宿主細菌，供其裂解以生長繁殖[8]。通常采用含0.1%聚蛋白胨的雙層瓊脂培養基[9]和自來水雙層瓊脂培養基[10]進行噬菌斑計數。

夏季高溫季節，細菌性病害嚴重危害水產養殖業，造成較高的發病率和病死率，針對蛭弧菌能夠裂解細菌，替代抗生素的特性，于2018年5月在異育銀鯽養殖試驗塘內添加含蛭弧菌微生態制劑，通過細菌計數及細菌性病害的發病率和病死率來研究蛭弧菌對異育銀鯽養殖塘的生物防治作用。

1 材料與方法

1.1 試驗塘

射陽縣發陽水產養殖公司1號及2號養殖塘，池塘面積約6 000 m2，均為長方形土池塘，水深1.2～1.5 m，設1號為試驗塘，2號為對照塘，塘內所養異育銀鯽為同一時間放養，且數量及規格一致。

1.2 培養基

LB營養肉湯培養基、瓊脂粉購自廣州環凱生物制品有限公司，3M細菌培養計數片購自南京某公司，自來水雙層瓊脂培養基（自配）：下層為1.5%自來水瓊脂，上層為0.6%自來水瓊脂。

1.3 菌株

大腸桿菌標準菌株購自中國農業微生物保存中心，蛭弧菌微生態制劑（菌普康）為南京某公司生產。

1.4 細菌總數測定

分別采集試驗塘和對照塘內水樣，進行倍比稀釋后，吸取1 mL加入3M細菌培養計數片中，30℃恒溫培養箱培養48 h后進行細菌計數。

1.5 蛭弧菌總數測定

1.5.1 蛭弧菌微生態制劑的使用 按照蛭弧菌微生態制劑使用說明書，用滅菌純凈水溶解蛭弧菌凍干粉，于5月初在1號塘進行全塘潑灑，對照塘潑灑同等體積滅菌純凈水。

1.5.2 宿主菌懸液制備 將大腸桿菌接種于LB液體培養基中，37℃溫箱振蕩培養8 h，培養液經離心去上清，加入滅菌生理鹽水混勻備用。

1.5.3 蛭弧菌計數 將宿主懸液吸取1 mL加入6 mL上層瓊脂試管中迅速搖勻，分別加入采集的試驗塘及對照塘水樣0.1 mL，混勻后倒入已配好的下層瓊脂上，待培養基凝固，倒置30℃恒溫培養箱培養，待噬菌斑形成后計數。

1.6 細菌性病害發病率統計

6—9月高溫季節，每天早中晚3次巡查試驗塘及對照塘，每周隨機拉網捕撈30～40尾，觀察體表狀態，根據癥狀判斷是否為細菌性疾病，分別計算試驗塘及對照塘細菌性疾病發病率。

2 結果

2.1 蛭弧菌及細菌總數

潑灑前通過池塘互通換水，控制試驗塘和對照塘細菌總數均為5.4×106CFU/mL，蛭弧菌濃度均為1.6×102PFU/mL；試驗結束后試驗塘蛭弧菌濃度上升為 8.2×105PFU/mL，細菌總數下降為 3.7×105CFU/mL，對照塘細菌總數和蛭弧菌濃度均略上升，具體結果如表1所示。

2.2 細菌病害發病率統計

通過6—9月高溫季節，異育銀鯽細菌性病害發病率統計，1號試驗塘細菌性病害發病率明顯低于2號對照塘，如圖1所示。

3 小結與討論

通過試驗塘及對照塘數據對比發現，添加蛭弧菌的試驗塘，經過30 d試驗周期，蛭弧菌數量顯著增加，細菌總數大幅下降，而對照塘，蛭弧菌數量和細菌總數保持微增長，分析可能是氣溫升高，水溫上升，細菌及蛭弧菌繁殖加快所致。后期數據采集結果顯示，添加蛭弧菌的試驗塘，細菌性疾病發病率明顯低于對照塘，結合前期細菌總數，表明蛭弧菌對異育銀鯽養殖池塘具有較好的殺菌效果，可降低細菌性疾病的發生。

表1 試驗周期蛭弧菌及細菌總數變化

圖1 試驗塘與對照塘6—9月發病率統計

蛭弧菌作為寄生性細菌，不僅僅能夠裂解宿主細胞，同時還能夠有效地降低養殖水體中氨氮等有害物質含量[11]。因此，自1994年國家批準蛭弧菌在動物養殖上使用以來，蛭弧菌在我國水產養殖中的應用已經非常廣泛[12]。目前，我國對蛭弧菌的研究可分為凈化水質，殺滅細菌及促進動物體非特異性免疫這3大類。但是蛭弧菌的研究仍然處于初步階段，關于蛭弧菌在殺滅細菌的同時，是否會破壞養殖水體的微生物種群以及養殖動物腸道菌群結構等都仍然是未知問題，建立安全并且完善的蛭弧菌制劑使用程序，才能夠更好的發揮蛭弧菌的作用，促進水產養殖業的健康發展。