豬源大腸桿菌耐藥性及超廣譜β-內酰胺酶流行性分析

，， ，，，邱華，，，

大腸桿菌(Escherichiacoli)屬于革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界，為人和動物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起仔豬黃、白痢和仔豬水腫病，在獸醫臨床上屬于多發常見病，發病率和死亡率普遍較高。β-內酰胺類藥物是獸醫臨床重要的抗感染藥物，廣泛用于動物疾病的治療。隨著近十多年來，β-內酰胺類藥物在獸醫臨床上長期不合理的使用，導致耐藥菌株的產生并且廣泛擴散流行，抗菌效果降低甚至喪失，導致大批量動物死亡，給豬場養殖業帶來巨大的經濟損失。超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是介導大腸桿菌對第三代頭孢菌素耐藥的重要機制。ESBLs耐藥基因由質粒攜帶可通水平傳播，在全球范圍內迅速擴散，造成耐藥。同時動物源產 ESBLs 大腸桿菌可經食物鏈直接或間接傳播給人，給人類的健康造成嚴重威脅。

目前，福建地區豬源大腸桿菌ESBLs流行病學的研究資料相對較少。因此，本實驗對該地區分離的豬源大腸桿菌ESBLs流行性進行調查以及種系發育進行分析，旨在闡明該地區分離株的ESBLs流行分布特征和種系發育進行情況，以期對該病原菌耐藥性風險評估及獸醫臨床合理使用藥提供一定的科學依據。

1 材料和方法

1.1細菌分離與鑒定 2014-2016年采用肛門拭子采集規模化豬場糞便樣品，將采集的糞便樣品在潔凈工作臺中接種于3 mL滅菌的LB肉湯中，37 ℃震蕩培養箱增菌12～24 h，再用接種環接取少量菌液均勻劃線于麥康凱瓊脂上， 37 ℃培養箱12～24 h，挑取麥康凱瓊脂上紅色不透明中等大小可疑單菌落進行純化并鑒定。所有分離株經革蘭氏染色后鏡檢、生化鑒定和16S rRNA[1](F：AGAGTTTGATCTGGCTCAG，R:GGTTACCTTGTTACG-ACTT)分析檢測。分離株保存在終濃度為30.0%甘油肉湯中，-20 ℃冰箱保存備用。大腸桿菌ATCC 25922作為藥敏質控菌，由本實驗室保存。

1.2藥物與試劑 麥康凱瓊脂(MacConkey Agar)，LB肉湯(LB Broth)，LB瓊脂(LB Agar)，水解酪蛋白瓊脂(MH Agar)，水解酪蛋白肉湯(MH Broth)，均購自廣州環凱微生物科技有限公司；氨芐西林、頭孢噻呋、慶大霉素、卡那霉素、四環素、多西環素、氟苯尼考、萘啶酸、恩諾沙星、環丙沙星和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，購自中國獸醫藥品監察所；頭孢噻肟購自中國藥品生物制品檢定所；rTaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；引物合成和PCR產物序列測定由華大生物科技(上海)有限公司完成。

1.3藥物敏感性測定 大腸桿菌藥物敏感性的測定方法參考美國臨床實驗室標準化委員會(M100-S25)推薦方法執行，采用瓊脂二倍稀釋法測定分離菌株的最低抑菌濃度(MIC)，以完全抑制細菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度。其中頭孢噻呋[2]和氟苯尼考[3]的耐藥折點參考文獻報道，恩諾沙星的耐藥折點參考(CLSI，M3-A3)雞大腸桿菌的耐藥折點，并根據MIC的測定值，計算每種藥物的MIC50和MIC90。大腸桿菌ATCC 25922作為藥敏質控菌株。

1.4基因組DNA提取 用水煮法提取DNA模板，將鑒定純化的大腸桿菌劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養12～24 h后，挑取單個菌落接種于4 mL LB肉湯中，37 ℃振蕩培養12～24 h，將菌液分裝到2 mL 的EP管中12 000 r/min離心2 min，棄上清，加入250～300 μL 滅菌超純水，置于沸水浴10 min，冰浴5 min后，12 000 r/min離心5 min，取上清液至另一滅菌EP管，儲于4 ℃冰箱保存。

1.5ESBLs基因的檢測及CTX-M亞型分析 試驗檢測了ESBLs耐藥基因，包括TEM、SHV、OXA和CTX-M基因，其中CTX-M 型包括CTX-M-1G和CTX-M-9G，引物序列參考相關文獻報道，見表1。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的基因的PCR產物經序列測定后提交NCBI平臺通過BLAST進行分析確認。

1.6種系發育關系分析 根據Clermont等文獻報道的方法判斷大腸桿菌種族系統進化關系[4]。采用多重PCR及交叉式檢索表的方法，以chuA基因、yjaA基因及一個未知 DNA片段 TspE4.C2的存在或缺少為依據來判定菌株所在的種族。

表1 基因引物序列及片段長度
Tab.1 Primer sequences of genes and gene length

基因類別基因名稱 引物序列(5'-3')片段長度(bp)超廣譜β-內酰胺酶TEM5'-ATAAAATTCTTGAAGACGAAA-3'1080[5]5'-GACAGTTACCAATGCTTAATC-3'SHV5'-CACTCAAGGATGTATTGTG-3'885[6]5'-TTAGCGTTGCCAGTGCTCG-3'OXA5'-TGAAGGGTTGGGCGATTT-3'925[7]5'-ACCCGGAGCCTCATTAATTGT-3'CTX-M-1G5'-CTTCCAGAATAAGGAATCCC-3'949[8]5'-CGTCTAAGGCGATAAACAAA-3'CTX-M-9G5'-GTGACAAAGAGAGTGCAACGG-3'857[6]5'-ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC-3'種系發育chuA5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3'279[4]5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3'yjaA5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3'211[4]5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3'TspE4C25'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3'152[4]5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3'

注：F，上游引物；R，下游引物

2 結 果

2.1細菌分離情況 2014-2016年期間，從福建地區規?；i場糞便中共分離大腸桿菌373株。大腸桿菌在麥康凱培養基上菌落呈圓形凸起，邊緣整齊，粉色至深紅色；在伊紅美藍培養基上，菌落中心呈黑色，有金屬光澤。分離株經革蘭氏染色及油鏡觀察，呈紅色短桿菌；生化鑒定結果符合大腸桿菌的相關特征；16S rRNA檢測，可獲得1 500 bp的目的條帶，經測序并分析，確認分離株為大腸桿菌。

表2 大腸桿菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度
Tab.2 Distribution of minimum inhibitory concentration values for antimicrobials inEscherichiacoliisolates

藥物名稱MIC各濃度菌株分布 (μg/mL)≤0.030.060.1250.250.51248163264128≥256氨芐西林00131561221193562736858頭孢噻呋1032152622425537312222311018頭孢噻肟8261332497654261526718815慶大霉素0011214313836474356412529卡那霉素00667132425465043595836表2(續)藥物名稱MIC各濃度菌株分布 (μg/mL)≤0.030.060.1250.250.51248163264128≥256四環素0051024203542394454373924多西環素01153015253934404349361828氟苯尼考000216141121344539686657萘啶酸000000417142950939373 恩諾沙星212153156543531252434271215環丙沙星315222735535444381326181411甲氧芐啶/磺胺甲噁唑0000291218192843699578

表3 大腸桿菌對抗菌藥物的MIC50、MIC90和耐藥率
Tab.3 MIC50, MIC90and resistance rates for antimicrobials inEscherichiacoli

藥物名稱MIC50(μg/mL)MIC90(μg/mL)耐藥折點(μg/mL)敏感 (S)耐藥 (R)耐藥率氨芐西林64256≤8≥3270.0%頭孢噻呋264≤2≥835.9%頭孢噻肟164≤1≥430.8%慶大霉素16128≤4≥1652.0%卡那霉素32128≤16≥6441.0%四環素16128≤4≥1653.1%多西環素8128≤4≥1646.6%氟苯尼考64256/≥1673.7%萘啶酸64256≤16≥3282.8%恩諾沙星264≤0.5≥254.4%環丙沙星264≤1≥444.0%甲氧芐啶/磺胺甲噁唑64256≤2≥493.8%

注：“ / ” 表示無耐藥折點可參考。

2.3ESBLs基因的流行情況 采用PCR方法檢測了ESBLs耐藥基因，在373株大腸桿菌中，共有122株菌攜帶有ESBLs耐藥基因，檢出率為32.7%，其中CTX-M、TEM及OXA的檢出率分別是18.0%(67)、12.1%(45)和7.5%(28)，SHV基因未檢出，并且CTX-M以CTX-M-9G的檢出率最高14.7%(55/373)，CTX-M-1G的檢出率為3.2%(12/373)。CTX-M-9G亞型分析表明CTX-M-14最為流行(61.9%，38/55)，其次是CTX-M-65(21.8%，12/55)和CTX-M-48(9.1%，5/55)，其種系發育顯示分離株主要分布在A群，其次是D群。CTX-M-1G主要以CTX-M-55亞型最為流行(83.3%，10/12)，主要以A群為主。部分CTX-M陽性株還攜帶有其他的ESBLs基因，其中有10株菌同時攜帶CTX和TEM基因，另有8株菌同時攜帶CTX和OXA基因，試驗結果見表4。

表4 大腸桿菌耐藥基因CTX-M亞型及種系發育分布
Tab.4 Distribution of the subtype and phylogeny of theEscherichiacolicarried CTX-M genes

3 討 論

本研究調查了福建地區豬源大腸桿菌對臨床常用的12種抗菌藥耐藥情況，結果表明該地區豬源大腸桿菌耐藥性較為嚴重，主要體現在耐藥率及耐藥水平均較高。對甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、萘啶酸、氟苯尼考及氨芐西林的耐藥率在70%～93.8%之間，并且MIC值大于等于64 μg/mL菌株數均超過50%，在51.2%～69.4%。β-內酰胺類藥物作為獸醫臨床重藥的抗感染藥物，尤其是第三代頭孢菌素，在本試驗中分離株對頭孢噻肟(30.8%)和頭孢噻呋(35.9%)表現出較強的耐藥性，與廣東(34.5%，37.9%)和四川(40.4%，頭孢噻呋)的報道相接近，但是明顯低于貴州(93.29%，頭孢噻呋)的耐藥率，另一常用藥氨芐西林的耐藥率為70%，與廣東，四川、貴州等地相似(79.3%～91.25%)[9-11]，均處于在較高的耐藥水平。β-內酰胺類藥物耐藥性快速增長，可能跟該類藥物的大量使用有關。氟苯尼考作為廣譜抗菌藥同樣被大量使用，本實驗中氟苯尼考的耐藥率高達73.7%，該結果與四川73.97%相似[9]，但貴州地區的實驗結果顯示氟苯尼考的耐藥率僅為21.95%[10]，表現出相對較好的敏感性。

目前，ESBLs以TEM、SHV、CTX-M和OXA型較為常見，其中以CTX-M型最為流行[12-14]。到目前為止CTX-M型已有100多種，并可分為 5個亞群：CTX-M-1G、CTX-M-2G、CTX-M-8G、CTX-M-9G 和CTX-M-25G[15]，并且在CTX-M陽性大腸桿菌中CTX-M-9G基因檢出率最高[13, 16]。本研究在福建多個地區采集的373株大腸桿菌中，32.7%的菌株攜帶有ESBLs基因，高于2015年福建閩西的地區28.6%的檢出率[17]，其中CTX-M的檢出率最高為18.0%，同樣以CTX-M-9G最為流行(55/67)，但是也有不同的情況，王基偉[18]及佐明開[19]對吉林和江西的研究結果表明，最為流行是TEM型，而非CTX-M型。

本研究顯示CTX-M中最為流行亞型是CTX-M-14、其次CTX-M-65和CTX-M-55，然而2015年福建閩西地區調查結果顯示，最為流行的亞型是CTX-M-15[17]，與本試驗結果明顯不同，CTX-M-14屬于CTX-M-9G，而CTX-M-15屬于CTX-M-1G，并且CTX-M-15在本研究中未檢出，說明在該地區流行的亞型很可能已經發生改變。2011年，鄭紅青等研究廣東地區豬源產ESBLs大腸桿菌，結果表明CTX-M-14最為流行，其次是CTX-M-55和CTX-M-65[16]。然而2016年，靳嬋調查廣東地區屠宰前豬源大腸桿菌CTX-M流行情況時，發現不僅CTX-M的檢出率相對較低，其流行的亞型也不一樣，檢出率最高的為CTX-M-55，其次為CTX-M-14和CTX-M-65[20]，以上研究結果表明檢出率和流行的亞型存在一定的差異，可能是與樣品來源不同、地域差異及管理水平等因素有關。值得注意的是同一個養殖場，不同的樣品來源，CTX-M的流行亞型也不同[21]。

種系發育是大腸桿菌分子流行病學的重要特征，根據TSPE4.C2、yjaA及chuA這三個基因的不同組合，可將大腸桿菌分為 A、B1、B2 和 D 這 4 個種系發育型。共生型大腸桿菌主要分布在A組，毒力因子較多的常常位于B2組和D組[22-24]。健康豬源大腸桿菌主要分布在A群和B1群，腹瀉仔豬大腸桿菌分布在B2和D群的比例顯著高于健康豬源[18]。有資料表明，動物源CTX-M-14和CTX-M-55基因陽性的大腸桿菌，其種系發育均以A組為主[13, 25]。本實驗中，CTX-M-14、CTX-M-65和CTX-M-55，大多數屬于A組，占CTX-M陽性菌的70.1%，與他人的研究結果一致，說明CTX-M陽性菌多數以共生型大腸桿菌為主。

利益沖突：無