棘球蚴(包蟲)病疫苗研究進展

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絳蟲蚴病(Metacestodiasis)是由絳蟲的幼蟲寄生在動物(包括人)體內引起的一類寄生蟲病。帶科(Taeniidae)的帶屬(Taenia)和棘球屬(Echinococcus)絳蟲的幼蟲危害尤為嚴重[1-2]，分別稱為囊尾蚴(俗稱囊蟲)和棘球蚴(俗稱包蟲)，它們通過消化道感染宿主，借助血液或者淋巴循環遷移到寄生部位，廣泛寄生于草食性動物或雜食性動物(包括人)等的體內，分別引起囊尾蚴病(Cysticercosis，俗稱囊蟲病)和棘球蚴病(Echinococcosis，俗稱包蟲病)。棘球蚴病中危害最嚴重的是細粒棘球蚴和多房棘球蚴，分別引起中間宿主(包括人)的囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis, CE)和泡型棘球蚴病(Alveolar echinococcosis, AE)，全球每年因棘球蚴病給畜牧業造成的經濟損失和用于棘球蚴病患者的治療費用合計高達30億美元，僅囊型棘球蚴病每年可造全球1 000 000～3 000 000的傷殘調整生命年(DALYs，disability adjusted life years)的損失(http://www.who.int/echinococcosis/epidemiology/en/)；多房棘球蚴病更有“蟲癌”之稱，感染后未經治療的多房棘球蚴患者的10年病死率可高達94%[3]。因此，帶科絳蟲尤其是棘球絳蟲，不但對畜牧業的發展影響巨大，而且嚴重危害人類身體健康，在公共衛生學上具有重要意義[4-5]。

棘球蚴病不僅給養殖業造成了嚴重危害，而且人感染棘球蚴病的報道也居高不下，為了防治本病，驅蟲藥被大量投入使用，并取得了一定的效果，但是由于長期使用化學藥物，出現了耐藥性、藥物殘留、環境污染等一系列問題。而疫苗具有安全、無殘留、動物無休藥期、符合“預防為主，治療為輔”工作方針等優點，是疫病防控的重要手段之一，同時現代生活中寵物數量越來越多，寵物主人對寵物的寄生蟲防治更傾向疫苗防治，所以研制有效的寄生蟲病疫苗對畜牧業發展和人民生活質量提高都有重要意義[6]。

棘球蚴疫苗研制經歷了傳統的六鉤蚴、細胞培養物等組織細胞疫苗；到新型疫苗的出現，如多肽疫苗、核酸疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、以及利用基因工程技術開發的轉基因植物疫苗等。隨著時代和技術的進步，更加理想的新型疫苗相信也會相繼出現。總的來說，尋找具有更加高效、持久、廣譜、簡便、廉價、安全等優點的疫苗是疫苗研制發展的方向[7]，下面對棘球蚴病疫苗研究進展做一綜述。

1 組織細胞疫苗

早期的棘球蚴病疫苗主要是由棘球絳蟲分泌物和代謝物、蟲卵、六鉤蚴或原頭蚴分泌物、細胞培養物等制成的，免疫動物可以得到強的免疫保護力，朱興全等[8]和Osborn等[9]分別對細粒棘球絳蟲六鉤蚴分泌物抗原性研究發現，其免疫保護力分別可達96.04%和99.40%，但是因為粗制抗原成分復雜，含有多種抗原蛋白[10]，生產成本高，難以進行批量生產[11]，并且飼養犬只可能會造成工作人員被感染，存在有公共衛生隱患等問題。所以隨著分子生物學的發展，組織細胞疫苗不可避免地已被其他類型的疫苗所代替。

2 合成肽疫苗

棘球蚴病合成肽疫苗是根據棘球蚴的有效保護性免疫抗原中已知或預測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過人工設計和合成的具有免疫原性的多肽疫苗。目前寄生蟲病中研究較多的主要是瘧疾和血吸蟲病合成肽疫苗，合成肽疫苗在棘球蚴病和囊尾蚴病方面也有研究和應用。

Eg95蛋白廣泛存在于細粒棘球絳蟲六鉤蚴、育囊生發層、原頭蚴以及成蟲體表[12]，在細粒棘球絳蟲生長發育中必不可少，這提示Eg95蛋白能夠誘導宿主產生免疫保護。Woollard等[13]對細粒棘球絳蟲的保護性抗原Eg95進行抗原表位分析，根據分析結果人工合成4條短肽，免疫羔羊試驗顯示這4條短肽僅具有免疫原性，能夠誘導產生明顯的特異性抗體，但沒有反應原性，免疫保護力(0%)遠不如Eg95(保護力高達99.8%)，說明兩種抗體之間存在著差異，這些多肽和Eg95疫苗對宿主免疫保護的關系還需后續研究。Woollard等[14]也對重組疫苗抗原Eg95的保護性多肽做了定位分析，結果表明Eg95疫苗誘導免疫應答的主要部位是構象表位，宿主的保護性抗原表位也是構象表位，這為棘球蚴病合成肽疫苗的研制提供了理論依據。

合成肽疫苗完全是人工合成，不含核酸，能夠克服常規疫苗的一些缺陷，被認為是一種更加高效、簡便、穩定、經濟的疫苗，但是合成肽疫苗的抗原性及其免疫原性受自身組成及宿主免疫系統等多種因素的影響，并且發現免疫力不能垂直傳遞，新生仔豬對囊尾蚴仍易感，需要再次免疫[15]，還有中和表位多為構象表位，這些問題都給合成肽疫苗的研制和推廣應用帶來了阻力。目前合成肽疫苗是預防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的主要新型疫苗研制方向之一，在棘球蚴病中研究較少，所以更加有效、實用的棘球蚴病合成肽疫苗需要進一步的探究。

3 基因工程重組疫苗

基因工程重組疫苗是運用DNA重組技術，將編碼病原保護性抗原的基因導入原核或真核表達系統，使其高效表達，提取保護性抗原肽鏈，加入佐劑即制成基因工程重組疫苗。與傳統疫苗相比，基因工程疫苗具有以下優點：1)可大量生產，降低生產陳本；2)可以研制多價疫苗，達到一針防多病的目的；3)安全性好。總得來說，絳蟲的保護性抗原主要有以下4類，即16K、18K、45W和Eg95(如表1所示)，其保護率多高于95%[16]，這些保護性抗原主要在絳蟲六鉤蚴時期表達，能夠誘導宿主很好的免疫保護力，其中部分疫苗(如細粒棘球絳蟲疫苗Eg95)已經商業化，所以有效的保護性抗原研究對疫苗制備至關重要。

表1 帶科絳蟲常見保護性抗原
Tab.1 The common protective antigens ofTaeniidaecestode

蟲種保護性抗原羊帶絳蟲To16、To18、To45S、To45W等牛帶絳蟲TSA45W、TSA18、TSA9等豬帶絳蟲TSOL18、TSOL16、TSOL45-1、TSOL45W、KETc1、KETc7、KETc12、AgB、Cc1等多頭帶絳蟲Tm45W、TM16、TM18等棘球絳蟲Eg95(以及其同源蛋白EgA31、EM95和EgM)、熱休克蛋白70(HSP70)、親肌肉抗原myophilinc、EgG1Y162、Eg14-3-3、Em14-3-3、EmP29、Em-TSP1、Em-TSP3等其他Prx(抗氧化酶系)、TPx(硫氧化還原蛋白過氧化物酶)、SOD(超氧歧化酶)等

3.1 基因工程重組蛋白疫苗

3.1.1針對中間宿主的疫苗 近年來，隨著組學和大數據時代的到來，多種棘球絳蟲抗原靶分子被挖掘發現，其中，棘球絳蟲Eg95重組蛋白的研究一直是棘球絳蟲疫苗研究的熱點，并取得了很大的進展，目前，重組蛋白的獲取有多種途徑，如大腸桿菌原核表達、酵母真核表達、昆蟲桿狀病毒表達等，不同的方法各有優缺點，真核表達系統具有分泌性高效表達外源蛋白、可對蛋白進行加工修飾(如糖基化、磷酸化和形成二硫鍵等功能)、蛋白更加接近天然狀態等原核系統所不具備的諸多優點[17-18]，在將來，真核表達系統將具有原核表達系統不可比擬的研究和開發潛力。

Eg95是迄今發現對細粒棘球絳蟲最有效的保護性抗原，三次免疫接種能誘導綿羊高達99%的保護率，免疫保護時間能長達11個月[19]；細粒棘球絳蟲硫氧還蛋白過氧化物酶(EgTPx)在保護蟲體免受宿主氧化損傷過程中起著關鍵的抗氧化作用，對蟲體在人和其他中間宿主體內穩定寄生、生長和存活十分必要，王慧等[20]對EgTPx的編碼基因進行原核表達，通過免疫小鼠，成功制備了EgTPx抗體(抗體效價高達1∶256 000)，為包蟲病疫苗和相關診斷試劑盒的研制奠定了一定的基礎，也對疫苗研制提供了一個新的思路。

作者所在的實驗室已獲得畢赤酵母系統高效表達Eg95重組蛋白國家技術發明專利(申請號：CN201210103512.1)，高密度發酵時上清中目的蛋白表達量在2 g/L以上，純度超過90%，產業化前景十分誘人。王慧等[21]將細粒棘球絳蟲的TPx基因在畢赤酵母中成功表達，獲得了具有高效表達能力的EgTPx基因工程真核表達菌株，并檢測到產物具有免疫反應性和抗氧化活性。目前，關于絳蟲代謝的抗氧化酶系的報道較少，但是依據抗氧化酶系在其他寄生蟲上的重要性推測，Prx或TPx在絳蟲的抗氧化作用中起清除過氧化氫等方面將有開拓性的發現[22]。

桿狀病毒表達系統最突出的特點就是能夠獲得高水平的蛋白表達，目的蛋白表達量最高可達到細胞總蛋白的50%[23]，同時還具有安全性好、能同時表達多個基因、重組蛋白翻譯后加工完整等特點。于琳琳等[24]成功構建獲得了Eg95-(C3d)3重組桿狀病毒表達系統，并且重組蛋白具有良好的免疫原性，同時證明用該重組蛋白檢測羊棘球蚴抗體有良好的敏感性和特異性。

哺乳動物細胞表達系統雖然其表達產量相對其他真核表達系統低，但是翻譯后加工更加精細，表達的蛋白質更加接近天然蛋白質，目前已成為多種生物藥物的首選宿主細胞[25]，王昌源等[26]成功構建了多房棘球絳蟲elp基因的真核細胞COS7表達系統，絳蟲蚴病疫苗在哺乳動物細胞表達系統中的研究工作相對較少，技術尚不成熟，有待進一步研究。

3.1.2針對終末宿主的疫苗 相對棘球絳蟲成蟲危害來說，棘球蚴對畜牧發展和人類健康造成的威脅遠大于成蟲，但是，成蟲大量寄生在犬等終末宿主腸道，終末宿主可以向外界排放大量的蟲卵，這使得犬等終末宿主成為棘球蚴病的主要傳染源，所以研制針對棘球絳蟲成蟲病的疫苗對絳蟲蚴病的防治也有重要的意義。EgA31是細粒棘球絳蟲成蟲發育調控的重要抗原蛋白之一，與原頭蚴和成蟲發育有密切關系，是疫病診斷和犬細粒棘球絳蟲蚴病的疫苗研制的候選抗原[27]，Petavy等[28]用沙門氏菌弱毒株成功制備了EgA31和EgTrp口服重組疫苗，對犬口服免疫，感染26～29 d后剖檢十二指腸發現，免疫犬細粒棘球絳蟲的荷蟲量減少了70%～80%，并減緩了蟲體發育的速度；EgM家族重組蛋白可以抑制了蟲體生長，尤其是蟲卵和胚胎的發育，由egm4、egm9和egm123三種蛋白編碼基因構建的重組疫苗，用原頭節對犬攻蟲，這三種蛋白可以誘導犬高達97%～100%的保護率[29]。

3.2基因工程重組病毒載體活疫苗 重組病毒載體活疫苗是人類免疫接種中應用最廣泛的疫苗，在天花、狂犬病、鼠疫等疫病的防控中起了重要作用，重組病毒載體活疫苗具有重組體用量少，抗體不需要純化，載體本身可發揮佐劑的作用等優點，同樣也具有一定的缺點：如感染或者接種過該病毒的動物或者人，對該載體病毒具有了免疫記憶，會影響免疫接種效果。

痘病毒常作為重組疫苗病毒(Recombinant vaccinia virus, VACV)載體，在基因工程重組載體病毒活疫苗中有廣泛應用。羊口瘡病毒(Orf virus)屬于痘病毒科副痘病毒屬的雙鏈DNA病毒，能夠引起綿羊、山羊和人嚴重的皮膚病變。Tan等[30]用羊口瘡病毒作為VACA，構建Eg95載體病毒活疫苗，目的是獲得雙價疫苗，結果產生針對羊口瘡病毒和針對Eg95的兩種特異性抗體，并且針對Eg95抗原的抗體水平與用純化抗原制備的疫苗水平相當，此實驗結果表明，羊口瘡病毒活載體疫苗有望成為新一代的二聯重組疫苗。同樣，Dutton等[31]將重VACA作為Eg95蛋白的傳輸載體，將Eg95蛋白的編碼基因插入VACV中，成功構建了重組痘病毒疫苗VV399，綿羊和小鼠試驗結果顯示該疫苗可以誘導免疫動物產生特異性抗體，并且免疫后的動物血清對六鉤蚴也有一定的殺傷作用。

3.3基因工程重組細菌載體活疫苗 同重組病毒載體活疫苗一樣，重組細菌載體活疫苗也有上述類似的優缺點。減毒沙門氏菌載體作為口服活疫苗載體具有廣泛的應用價值，是新型疫苗研究的熱點之一[32]，王志昇等[33]成功構建了以減毒鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)為載體的細粒棘球絳蟲Eg95蛋白的口服活載體疫苗，通過灌胃BALB/c小鼠四周后抗體水平高達1∶1 700，并且安全性實驗顯示安全性良好，說明該細菌載體活疫苗具有良好的免疫原性和安全性。

4 核酸疫苗

核酸疫苗又稱DNA疫苗，是通過宿主接種編碼特定抗原蛋白的核酸，使其在宿主體內表達，刺激宿主對該抗原蛋白產生特異性免疫應答反應，達到預防和治療疾病的目的。核酸疫苗是繼滅活疫苗、減毒疫苗、基因工程重組亞單位疫苗之后的“第三代”疫苗，目前瘧疾、弓形蟲病、血吸蟲病、棘球蚴病、囊尾蚴病等寄生蟲病的預防也開始應用核酸疫苗，并顯示有廣闊的應用前景[34]。

林仁勇等[35]用pcDNA3-Eg95核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，探討其誘導小鼠的體液和細胞免疫效果，結果顯示此核酸疫苗能夠在小鼠體內產生明顯的免疫反應。丁劍冰等[36]用細粒棘球絳蟲的Eg95核酸疫苗與Eg95重組亞單位疫苗做了比較，發現用前者免疫接種的小鼠產生IgG抗體滴度水平(1∶3 200)低于后者(1∶25 600)，但IgG2a亞類抗體水平卻明顯高于重組蛋白免疫實驗組，這證明了細粒棘球絳蟲Eg95重組抗原和核酸疫苗均可誘發小鼠產生特異性免疫應答。楊嬌馥等[37]將構建的重組質粒pcDNA3·1-eg95轉染綿羊胎兒成纖維細胞，檢測結果發現eg95基因在綿羊胎兒成纖維細胞中得到了轉錄，這為利用pcDNA3·1-eg95制備實用的棘球蚴病核酸疫苗提供了科學依據。

總之，核酸疫苗與普通疫苗相比具有更加快速、方便、特異性高、無危害性等優點，除此之外，核酸疫苗因其經濟成本較低，易與運輸和儲存，可以誘導機體產生全面的免疫反應，有制備多價苗的潛力(對不同亞型的病原體有交叉防御作用)，并且核酸疫苗可以在免疫動物體內直接表達，具有很好的應用前景[38]，但是絳蟲蚴病核酸疫苗研究較少，技術路線尚不成熟，安全性評估還存在很多的問題[39]，還需要進一步的研究。

5 轉基因植物疫苗

轉基因植物疫苗具有易運輸、可大規模生產、成本低廉、易獲得多價苗、使用方便(直接食用就可以較強的體液和黏膜免疫反應)等優點，苜蓿是草食性動物主要的飼料來源，并且蛋白含量高，營養豐富，所以常被選作是轉基因植物疫苗的對象。周輝等[40]對轉細粒棘球絳蟲Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗載體進行了成功的構建，葉艷菊等[41-42]在其基礎上研究了該疫苗的保護力及其免疫機制，結果表明轉基因苜蓿葉的蛋白提取液經口服和滴鼻接種都能誘導免疫鼠產生一定的保護力，并且Th1型免疫應答在免疫保護機制中起重要作用。

6 多價苗和聯苗

多價疫苗和聯苗對疫病的防控實施有重要的意義，多價苗和聯苗可以避免多次免疫，降低基層工作壓力，減少人力、物力的消耗，減少被接種動物的應激反應次數，到達一針防多病的目的。基因工程疫苗和核酸疫苗都具有多價苗和聯苗研制的潛力，所以有很大的發展空間，如上文描述的基因工程重組羊口瘡病毒活疫苗，就是一種對羊口瘡病毒和細粒棘球蚴感染同時有免疫預防作用的二聯苗[30]；細粒棘球絳蟲種內變異現象非常突出，G1(綿羊株)和G6(駱駝株，現命名為加拿大棘球絳蟲，E.canadensis)基因型在家畜中分布最為廣泛，pET30a-EgA31-Eg95重組質粒的成功構建[43]，對棘球蚴病多價疫苗的開發有重要指導作用，如可以研制棘球蚴病Eg95-Ec95基因工程重組亞單位雙價疫苗；pTc-sp7核酸疫苗就是一種對肥頭絳蟲和豬帶絳蟲成蟲及其六鉤蚴有高保護率的聯苗[44]。總得來說，絳蟲蚴病種類繁多，危害嚴重，研制有效的聯苗和多價苗是一個亟待解決的問題。

7 其 他

隨著科學技術的發展和研究的不斷深入，絳蟲蚴病疫苗除了以上所述外，新型疫苗也會層出不窮：1)重組噬菌體疫苗作為新型疫苗，可以誘導機體產生較高的免疫保護力，并且生產成本低，具有普通疫苗沒有的優點，是理想的新型疫苗之一，已有試驗證明噬菌體可以誘導豬的體液免疫和細胞免疫[45]；2)微膠囊可控緩釋疫苗使用微膠囊技術將特定的抗原包裹后制成的疫苗，緩沖胃酸等消化液的消化，絳蟲成蟲又多寄生在腸道，這對絳蟲蚴病(包括棘球蚴病)疫苗的研制有一定的指導作用；3)樹突狀疫苗在腫瘤免疫中取得了一定的成功，多房棘球蚴病生長為浸潤性生長，與腫瘤相似，有“蟲癌”之稱，相信不久的將來樹突狀疫苗也會在包括棘球蚴病在內的絳蟲蚴病中得到應用。

8 小結與展望

棘球蚴病是一類嚴重的人獸共患寄生蟲病。隨著對抗寄生蟲藥物耐藥性和藥物殘留等副作用的逐漸關注和重視，抗寄生蟲疫苗被廣泛接受和研發，疫苗作為有效防治疫病的手段之一，具有很好的應用前景。雖然絳蟲(蚴)病(包括棘球蚴病)疫苗已有組織細胞疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、基因工程疫苗、轉基因苜蓿疫苗、以及重組雙歧桿菌疫苗等多種類型疫苗的研究，對絳蟲蚴病的防控、畜牧業發展、食品安全以及人類身體健康等有重要意義，但是更加有效、實用、安全的絳蟲(蚴)病疫苗的研制還有很長的路要走。

目前，棘球蚴病疫苗還存在眾多問題。一、疫苗研制中宿主動物數量是否符合統計學意義對試驗結果的可靠性有重要作用，許多已發表的試驗結果不能有效、明確的評估實驗結果的優劣[46]；二、目前絳蟲(蚴)病疫苗針對性單一，大多數研究對象是絳蟲六鉤蚴時期的保護性抗原(如16K、18K、45W和Eg95四類抗原)，而對參與絳蟲代謝的抗氧化酶系、水解酶等研究較少，并且，目前絳蟲(蚴)病疫苗的研制多為只針對某一種病，所以研制針對寄生蟲多個階段的多價疫苗和同時可以預防多種寄生蟲的多聯疫苗，都是值得思考的問題；三、表達系統的問題，真核和原核表達都存在各自的優點和缺點[17, 47]，所以說，如何選擇有效的表達系統，是實驗前必須考慮的問題，表達量高、成本低、蛋白更接近天然構象的表達系統是亟待解決的問題之一；四、目前棘球蚴病疫苗僅限于獸用疫苗的研制，還沒有人用疫苗被研制成功，所以在未來，研制有效的人用棘球蚴病疫苗，在高危人群中使用，對廣大牧民以及從事相關工作人員的身體健康具有重要的公共衛生意義。

隨著生物技術的不斷發展，棘球蚴病疫苗的研究有了更多的思路和方法。首先，通過人工化學合成技術制備疫苗，可以有效解決一些病原體不能在體外培養獲得足夠抗原的困境，在未來疫苗領域有很大的應用空間；其次，隨著測序和高通量篩選技術的發展，為靶抗原的篩選提供了有力的技術支撐，以及長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)、微小核糖核酸(MicroRNAs, miRNAs)等非編碼序列的廣泛研究為疫病疫苗的研制提供了新的思路[48]；而且，高效基因編輯技術(CRISPR/Cas9)的出現和廣泛應用，一方面為新基因功能研究和疫苗候選分子篩選開啟了新的道路，另一方面，通過基因編輯改良的家畜新品種和動物模型研究成為可能(已有抗朊病毒的基因缺陷牛模型[49])，這些對疫病防控、畜牧業發展、公共衛生等都有重要的意義。

利益沖突：無