p28GANK 蛋白表達與肝癌發病的相關性分析＊

崔中鋒，張 瑩，姜 瑜

臨床流行病學 統計顯示，作為全球第五大惡性腫瘤和常見消化系統惡性腫瘤， 原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）在我國的發病率不斷升高，其惡性程度高，預后差，致殘率、病死率高。 目前， 關于PLC 的分子機制研究尚有待完善。p28GANK 為含有226 個氨基酸的蛋白 （分子量為25kDa）， 在 臨 床 上 又 將 其 稱 為P28GANK 或PSMD10。 p28GANK 最初由日本學者Fujita 等在人肝癌細胞中通過cDNA 文庫經消減雜交法克隆得到，并被認為是一個肝癌差異表達基因，能夠介導蛋白質之間的相互作用，發揮多種生物學功能［2］。隨后有 文獻［3-5］逐漸證實，p28GANK 蛋白的表 達水平與PLC、食管癌、胰腺導管癌等患者的病理特征及預后相關，但該基因促進PLC 發生、發展的作用機制目前尚未完全闡述清楚。 為此， 該文重點分析p28GANK 蛋白表達情況與PLC 發病相關性及其可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集2015 年3 月—2018 年3 月筆者所在醫院腫瘤科行手術切除治療并經病理證實的48 例PLC 患者的蠟塊組織標本，其中有28 例患者術中取得癌旁組織（選取標準為距離腫瘤包膜≥5 cm）。 所有標本經10%甲醛溶液固定及石蠟包埋，切片厚4 μm。 病例納入標準：（1）符合衛生部頒布的《原發性肝癌診療規范》（2011 年）［6］中相關診斷標準；（2） 肝功能按照Child 分級分為 A、B、C 級；（3）術前未經任何放化療或介入治療；（4）入選患者或其家屬均對該研究的目的和意義知情，并簽署知情同意書。 排除標準：（1）診斷為各種繼發性肝癌及門靜脈主干癌栓阻塞；（2）骨髓、腎和心臟功能嚴重受損或不全；（3）合并其他腫瘤疾病、嚴重感染、內分泌疾病、免疫疾病、精神或神經系統疾病；（4）臨床病歷與隨訪資料不全。 48 例PLC 患者中， 男27例，女21 例；年齡42～76 歲，平均（57．28±10．10）歲；最大腫瘤直徑＜5 cm 者27 例，≥5 cm 者21 例。 按照美國腫瘤聯合會（American Association of Cancer，AJCC）［7］制定的肝細胞肝癌分期：Ⅰ～Ⅱ期29 例、Ⅲ～Ⅳ期19 例，肝功能分級：A 級16 例、B 級22 例、C級10 例，伴淋巴結和（或）遠處轉移者19 例。 該研究符合該院倫理委員會及衛生部《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》的相關規定。

1.2 免疫組織化學法 均采用免疫組織化學S-P法染色法，獲取的組織切片常規脫蠟、水化處理后，置入3%過氧化氫溶液中并于室溫下孵育30 min 以阻斷內源性過氧化物酶，正常非免疫羊血清（福州邁新生物技術開發有限公司）置于室溫封閉30 min，滴加兔抗人p28GANK 單克隆抗體 （Santa Cruz 公司），濃度為1∶50，于密封濕盒中4 ℃過夜，滴加生物素標記二抗（即用型）與標記過氧化物酶的鏈霉菌抗生物素蛋白 （福州邁新生物技術開發有限公司），應用DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），蘇木素（Sigma 公司）復染及中性樹膠封片。

1.3 p28GANK 蛋白表達評判標準 結果評估參照文獻［8］的方法，以已知陽性的結腸腺癌切片做陽性對照， 陰性對照以磷酸緩沖鹽溶液代替一抗，由該院兩位醫師在不明確患者臨床病理資料的情況下進行顯微鏡下觀察，p28GANK 免疫組織化學染色陽性物質定位于細胞質和（或）細胞核。 每例患者的組織標本隨機觀察3 個視野（×200），以陽性細胞比例與染色強度判定染色結果。 無陽性細胞、陽性細胞＜30%、陽性細胞30%～60%、陽性細胞＞60%分別記0、1、2、3 分；無染色、弱陽性染色、陽性染色、強陽性染色分別記0、1、2、3 分；兩項評分分值之和0～2 分為p28GANK 表達陰性、3～6 分為陽性。

1.4 凋亡基因表達檢測 同樣采用以上方法（免疫組織化學S-P 法染色法）評估每例患者組織標本中凋亡相關基因Bcl-2、Bax 的蛋白質表達水平，其中即用型Bcl-2 鼠抗人單克隆抗體、Bax 鼠抗人單克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發有限公司，結果同樣以陽性細胞比例與染色強度判定染色結果。

1.5 統計學方法 選用統計學軟件SPSS19．0 分析和處理研究數據，計數資料采用%表示，不同病理組織p28GANK 蛋白表達陽性率及Bcl-2、Bax 蛋白表達陽性率對比采用χ2檢驗；p28GANK 蛋白表達與Bcl-2、Bax 蛋白表達的相關性采用Spearman 等級相關系數進行評價；PLC 組織p28GANK 蛋白與臨床病理特征關系均采用χ2檢驗； 以P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 p28GANK 蛋白及凋亡相關基因表達情況 組織中p28GANK 蛋白陽性表達多表現為棕黃色細小顆粒，定位于細胞核和細胞質；Bcl-2、Bax 蛋白的陽性產物亦為棕黃色顆粒，定位于細胞質中；見圖1。PLC 組織中p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織（P＜0．05），見表1。

2.2 p28GANK 蛋白表達與Bcl-2、Bax 蛋白表達的相關性 PLC 組織中p28GANK 蛋白表達陽性的36 例患者中29 例Bcl-2 蛋白表達陽性，而僅24 例Bax 蛋白表達陽性，Spearman 等級相關分析顯示，PLC 組織中p28GANK 蛋白與Bcl-2 蛋白陽性表達存在相關性，且差異具有顯著性（r=0．353，P＜0．05），而與Bax 蛋白陽性表達的相關性不具有顯著性（r=0．095，P＞0．05），χ2值比較見表2。

2.3 p28GANK 蛋白表達與病理特征的關系 不同性別、年齡、最大腫瘤直徑、肝功能分級的PLC 患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率無顯著性差異（P＞0．05），但Ⅲ～Ⅳ期患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期患者， 有淋巴結或遠處轉移的患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率高于無淋巴結或遠處轉移的患者，且差異具有顯著性（P＜0．05），見表3。

圖1 PLC 組織、癌旁組織p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白表達示例（×400）

表1 p28GANK 蛋白及凋亡相關基因表達情況［例（%）］

表2 p28GANK 蛋白表達與Bcl-2、Bax 蛋白表達的關系（例）

表3 p28GANK 蛋白表達與病理特征的關系

3 討 論

關于PLC 的發生、發展誘因尚為臨床研究的熱點問題， 目前已明確其與HBV、HCV、 黃曲霉毒素B1 等致癌因子引起的癌基因變化有關，例如N-ras基因、C-myc 基因、C-fos 基因的激活與p53 抑癌基因的失活等［9］。 由于p28GANK 是通過肝癌cDNA文庫消減雜交法獲得的相關基因，近年來對于其在肝癌中的研究逐漸受到關注。 Iwai 等［10］的早期肝細胞再生研究顯示，p28GANK 過表達發生于肝細胞再生的初期， 其表達相與細胞周期蛋白D1 上調及Rb 蛋白下降類似，提示p28GANK 有助于促進肝細胞再生。 分子機制報道［11］顯示，p28GANK 基因主要通過Rb、 鼠雙微基2 及p53 等信號途徑實現對細胞周期進程的調控、促進細胞的增殖及抑制細胞凋亡， 提示p28GANK 基因可能在細胞增殖和腫瘤發生發展中具有極為重要的作用。 李世杰等［12］的結果顯示，PLC 患者經動脈化療栓塞后殘余肝癌細胞中p28GANK 蛋白表達水平高。 該次研究結果顯示PLC 組織中p28GANK 蛋白及Bcl-2、Bax 蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織， 提示p28GANK 蛋白表達與PLC 的發生發展有關。

相關學者認為，p28GANK 促進腫瘤惡性進展的可能機制體現在： 三維晶體結構p28GANK 分子表面有凹槽，可與其他分子相互作用，繼而實現多種復雜的生物學功能， 如Rb 蛋白能夠調節腫瘤細胞增殖、凋亡等惡性生物學行為，p28GANK 上具備與Rb 相互作用位點， 可通過26S 蛋白酶體的S6b腺苷三磷酸酶來降解Rb， 或者直接與26S 蛋白酶體20S 核心結合介導其自我降解；p53 通路在腫瘤發生、發展中扮演了重要的角色，而p28GANK 可與MDM2N-端RING 結構域結合激活后者引起構象變化，繼而促使p53 泛素化及降解，間接促進細胞增殖與抑制細胞凋亡［13，14］。該研究Spearman 等級相關分析顯示，PLC 組織中p28GANK 蛋白與Bcl-2 蛋白陽性表達存在明顯的相關性（r=0．353），而與Bax蛋白陽性表達不相關 （r=0．095），Bcl-2 和Bax 一對凋亡因子，前者可抑制凋亡，而后者主要促進凋亡，二者通常用于反映腫瘤細胞的生長狀態，尤其是作為人類濾泡性淋巴斷裂點發現的癌基因，凋亡抑制因子Bcl-2 蛋白的過度表達可起到抑制腫瘤細胞凋亡的作用［15］。 該研究結果表明高p28GANK 蛋白表達可能通過上調凋亡抑制基因Bcl-2 的表達而影響腫瘤侵襲與轉移， 推斷可能機制為p28GANK與Bcl-2 均可通過作用于細胞凋亡的不同階段而發揮協同抗凋亡效應， 從而促進PLC 的發生與發展； 而p28GANK 與Bax 可能通過不同途徑作用于凋亡過程，因而二者陽性表達不具有相關性。

此外，莫瑞祥等［16］的報道認為p28GANK 蛋白過表達與PLC 的多項病理參數具有密切關系，本研究統計分析發現，不同性別、年齡、最大腫瘤直徑、肝功能分級的PLC 患者組織中p28GANK 蛋白陽性表達率無明顯差異， 但Ⅲ～Ⅳ期患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率明顯高于I～Ⅱ期患者，有淋巴結或遠處轉移患者組織p28GANK 蛋白陽性表達率明顯高于無淋巴結或遠處轉移的患者，進一步證實p28GANK 蛋白過表達可促進PLC 的惡性進展，尤其是腫瘤侵襲與轉移，可能與高p28GANK蛋白表達影響凋亡抑制基因Bcl-2 的表達有關，但p28GANK 與Bcl-2 的相互作用仍有待進一步闡明。