黑果枸杞葉槲皮素的制備及其體外抗氧化活性研究

段亞云，李建穎，程瑤，白金金

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

黑果枸杞為茄科枸杞屬植物，主要生長在荒地、沙漠等較為干旱的地區(qū)。其葉可以制茶、降血脂[1]。研究表明，黑果枸杞葉含有多種生物活性成分，隨著提取分離技術(shù)的不斷提高，對黑果枸杞葉化學(xué)成分的分析研究也在不斷深入，其主要作用有鎮(zhèn)靜安眠、鎮(zhèn)痛抗驚厥、抗氧化等[2]。

特別是對于黑果枸杞葉黃酮類化合物的研究表明，其具有一定的抗氧化活性，是天然抗氧化劑研究的熱點(diǎn)。槲皮素（quercetin）是黑果枸杞葉重要的黃酮成分之一，在治療糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠抑制實(shí)驗(yàn)大鼠腸道中的α-葡萄糖苷酶的活性，從而具有降血糖潛能[3]，但其抗氧化活性的系統(tǒng)研究鮮見報(bào)道。本研究采用清除DPPH自由基、ABTS+自由基等5種方法對槲皮素體外抗氧化活性能力作出評價(jià)，對其實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞葉：甘肅省民勤縣；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度：96.6%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH；D-101型大孔樹脂：南開大學(xué)化工廠；0.45 μm微孔濾膜：寧波和平注射器廠；葡聚糖Sephadex LH-20：天津贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；鉬酸銨、磷酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、磷酸鹽緩沖液、過硫酸鉀、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、三氯乙酸 （trichloroacetic acid ，TCA）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）（均為分析純）：天津鑫橋化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R50型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申生科技有限公司；DH-101電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UVD-680-1型紫外檢測儀：上海金達(dá)生化儀器有限公司；5418R型低溫冷凍離心機(jī)：德國艾本德有限公司；安捷倫1200高效液相色譜儀、G6410B Triple Quad LC/MS美國安捷倫科技有限公司；UV2550型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞葉總黃酮的提取

將黑果枸杞葉置于100℃烘箱中殺青30 min，放入60℃烘箱中，烘干至恒重，粉碎后過100目篩，經(jīng)超聲波-微波協(xié)同作用，在微波功率176 W，液料比19 ∶1（mL/g），提取時(shí)間 9.9 min，乙醇濃度 69%的條件下進(jìn)行提取。之后進(jìn)行抽濾，取濾液，經(jīng)55℃下減壓濃縮后，得黑果枸杞葉醇提物[4]。然后加水溶解通過D-101大孔吸附樹脂柱，依次采用蒸餾水，3 BV 25%乙醇，3 BV 45%乙醇，6 BV 95%乙醇進(jìn)行洗脫，收集95%乙醇洗脫液，真空干燥，即得黑果枸杞葉總黃酮。

1.3.2 槲皮素的分離純化

取一定量總黃酮，用20%甲醇超聲溶解，離心并采用0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，上樣于Sephadex LH-20色譜柱，依次用蒸餾水、30%甲醇、60%甲醇和無水甲醇進(jìn)行洗脫。設(shè)定流速為0.5 mL/min，收集餾分，每管10 mL（每1/20保留體積接成一餾分），共洗脫3個(gè)柱體積。洗脫完成后，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）檢測所得流分中黃酮類化合物的純度，合并相同組成流分。將最終得到的相應(yīng)黃酮類化合物分別進(jìn)行濃縮，干燥備用。由此可制備并純化槲皮素[5]。

1.3.3 槲皮素的結(jié)構(gòu)鑒定

采用HPLC-MS/MS鑒定所得的黑果枸杞葉黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，依據(jù)不同成分的色譜特征和質(zhì)譜特征的不同來鑒定黑果枸杞葉黃酮中的不同成分[6]，并由此確定槲皮素。

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：AgilentPoroshellEC-C18柱（4.6mm×50mm，2.7 μm）；流動相：乙腈-水（含 0.1%甲酸）=50∶50（體積比）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧ESI（-）；掃描方式：MS-Scan及Product Ion；電噴霧電壓：4 000 V；霧化氣體：N2；霧化氣壓力：35 p.s.i；霧化氣流速：10 L/min；離子源溫度：350℃；碰撞氣體：高純氮?dú)?；碰撞氣壓力?.2 MPa。

1.3.4 槲皮素體外抗氧化活性的測定

1.3.4.1 樣品溶液的配制

精密稱定槲皮素和蘆丁粉末，用50%乙醇稀釋樣品溶液，得到濃度分別為 20、50、100、200、300、400 nmol/L的樣品溶液。

1.3.4.2 試劑配制

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：精密稱取 8.0 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸餾水中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，定容? L即得pH值為7.4的PBS（0.2 mol/L）。

磷鉬試劑：分析天平精密稱取2.67 g磷酸鈉（Na3PO4·12H2O）于小燒杯中，加入 8.2 mL濃硫酸，充分?jǐn)嚢柚寥芙?；精密稱取1.24 g鉬酸銨[（NH4）6Mo7O24·4H2O]，倒入之前小燒杯中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙夂?，將小燒杯中溶液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，并用蒸餾水多次潤洗最終定容。磷鉬試劑的終濃度為0.6 mol/L濃硫酸，28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨的溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

DPPH工作液：精密稱取3.94 mg DPPH固體粉末，溶于100 mL無水乙醇中，配成DPPH工作液（1.0×10-4mol/L），4℃避光保存。

ABTS 工作液的配制：將 12 mLABTS（7.4 mmol/L）溶液與0.2 mL K2S2O8（2.6 mmol/L）混合，并在黑暗的條件下室溫保持12 h后，用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋40倍～50倍，以在734 nm處獲得0.68～0.72的吸光值，4℃避光保存。

NBT溶液：精密稱取124 mg NBT固體粉末，用PBS完全溶解至50 mL棕色容量瓶中，定容，得NBT工作液（0.3 mol/L），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

NADH溶液：精密稱取16.6 mg NADH固體粉末，用PBS充分溶解并置于50 mL棕色容量瓶中定容，得NADH工作液（0.468 mol/L），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PMS溶液：精密稱取0.812 mg PMS固體粉末，用PBS充分溶解并置于50 mL棕色容量瓶中定容，即得0.06 mol/L PMS工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

卵黃懸液：將卵黃與濃度為0.1 mol/L，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制成1∶1（體積比）懸液，磁力攪拌15 min，再用磷酸鹽緩沖液稀釋成pH值為1.25的懸液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4.3 總抗氧化能力

采用磷鉬絡(luò)合物法[7-8]測定槲皮素的總抗氧化活性。取不同濃度的樣品溶液0.6 mL于10.0 mL的具塞試管中，加入6.0 mL磷鉬試劑，渦旋混勻，于95℃恒溫水浴中反應(yīng)90 min。于695 nm波長下分別測定其吸光度。吸光度值越高表明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)。由此比較槲皮素與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化能力。

1.3.4.4 對DPPH自由基的清除作用

參照孫麗萍等[9]方法測定槲皮素清除DPPH自由基的能力。取不同濃度的樣品溶液0.1 mL于1.5 mL的離心管中，加入0.9 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L），渦旋混勻，閉光反應(yīng)30 min，于517 nm波長下分別測其吸光度，記作A；用50%乙醇代替樣品溶液，測其吸光度，記作A1；用無水乙醇代替DPPH溶液，測其吸光度，記作A0。根據(jù)公式（1）計(jì)算清除率。

1.3.4.5 對ABTS+自由基的清除作用

參照Payet等[10]和孟慶煥等[11]方法測定槲皮素清除ABTS+自由基的能力。取4 mL的ABTS+工作液于試管中，加入1 mL 95%的乙醇，混合均勻后靜置6 min，于734 nm波長下測定吸光度值為A0。將乙醇換成樣品溶液用同樣的方法測定吸光度為A。根據(jù)公式（2）計(jì)算清除率。

1.3.4.6 對超氧陰離子自由基的清除作用

取1 mL 50%乙醇于1.5 mL離心管中，作為參比進(jìn)行空白對照；于1.5 mL離心管中先后加入0.5 mL PBS、0.125 mL NADH、0.125 mL NBT、0.125 mL PMS，取不同濃度樣品溶液0.125 mL于離心管中，搖勻后室溫下反應(yīng)5 min，測定其在560 nm處的吸光度值A(chǔ)；用0.125 mL 50%乙醇替換樣品溶液，同樣的方法測定其在560 nm處的吸光度值A(chǔ)1；向1.5 mL離心管中先后加入0.875 mL PBS、0.125 mL樣品溶液，測定其在560 nm處的吸光度值A(chǔ)0。清除率的計(jì)算公式見公式（1）。

1.3.4.7 對脂質(zhì)過氧化體系的抑制作用

參照胡貴麗等[12]方法測定槲皮素對脂質(zhì)過氧化體系的抑制作用。取0.1 mL卵黃懸液、0.1 mL樣品溶液于離心管中，加入0.1 mL FeSO4（25 mmol/L），用磷酸鹽緩沖液定容至1.0 mL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取出后加入0.25 mL 20%TCA溶液，靜置后離心10 min，取0.4 mL上清液，加入0.2 mL 0.8%TBA溶液，于沸水浴中反應(yīng)15 min，冷卻后，于532 nm波長處測定吸光值A(chǔ)1，參比管為磷酸鹽緩沖液，其他步驟相同，測定吸光值A(chǔ)0，根據(jù)公式（3）計(jì)算樣品液對卵黃脂蛋白的脂質(zhì)過氧化抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的定性鑒定

槲皮素二級質(zhì)譜圖如圖1所示。

由二級質(zhì)譜圖得知：分子離子峰為301.0[M-H]-，表明該化合物相對分子質(zhì)量為302，近似于槲皮素的相對分子質(zhì)量。其他離子峰：151.0[M-150]-，120.5，以上離子碎片符合槲皮素的裂解規(guī)律。進(jìn)一步參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]，即可鑒定該化合物為槲皮素。

槲皮素的色譜圖如圖2所示。

由槲皮素的色譜圖得知：出現(xiàn)的色譜峰單一，且峰型、走勢良好，呈左右對稱，說明該化合物槲皮素成分單一，且純度較高。

2.2 體外抗氧化活性的評價(jià)

2.2.1 總抗氧化能力

依據(jù)吸光度所得的槲皮素總抗氧化能力，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，研究槲皮素的抗氧化活性。測定結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品有較好的抗氧化能力，而槲皮素在20 nmol/L～300 nmol/L時(shí)表現(xiàn)出抗氧化能力的不穩(wěn)定性，但隨著濃度的升高，抗氧化性逐漸增強(qiáng)，且趨于穩(wěn)定。在濃度為50 nmol/L～400 nmol/L范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的總抗氧化能力高于槲皮素的總抗氧化能力。

圖1 槲皮素質(zhì)譜圖Fig.1 The mass spectrogram of quercetin

圖2 槲皮素色譜圖Fig.2 The chromatogram of quercetin

圖3 總抗氧化能力Fig.3 The total antioxidant capacity

2.2.2 對DPPH自由基的清除作用

依據(jù)公式（1）所得的槲皮素對DPPH自由基的清除率，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，研究槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 對DPPH自由基的清除能力Fig.4 The scavenging activity on DPPH free radical

由圖4可知，在20 nmol/L～400 nmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，兩者清除DPPH自由基的能力明顯提高，且槲皮素的清除率與濃度量效關(guān)系十分明顯。溶液濃度為400nmol/L時(shí)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品清除率高達(dá)87.86%，槲皮素的清除率也大于35.04%。但總體來說，在此濃度范圍內(nèi)二者清除DPPH自由基的能力有一定差距。

2.2.3 對ABTS+自由基的清除作用

依據(jù)公式（2）所得的槲皮素對ABTS+自由基的清除率，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，研究比較槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 對ABTS+自由基的清除能力Fig.5 The scavenging activity on ABTS+free radical

由圖5可知，槲皮素和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對ABTS+自由基均表現(xiàn)出不同程度的清除活性。二者均隨其濃度的增加，清除率也隨之增大，特別是槲皮素，濃度與清除率呈明顯的量效關(guān)系，溶液濃度為400 nmol/L時(shí)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品清除率高達(dá)96.8%以上；槲皮素的清除率也大于68.0%。

2.2.4 對超氧陰離子自由基的清除作用

依據(jù)公式（1）所得的槲皮素對超氧陰離子的清除率，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，研究比較槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，測定結(jié)果如圖6所示。

圖6 對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.6 The scavenging activity on the super-oxide anion free radical

由圖6可知，在50 nmol/L～400 nmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著槲皮素和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增大，對超氧陰離子自由基的清除率逐漸增強(qiáng)；濃度低于40 nmol/L時(shí)槲皮素對超氧陰離子的清除能力高于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對超氧陰離子的清除能力，當(dāng)濃度高于40 nmol/L時(shí)，結(jié)果相反，蘆丁對照品在濃度400 nmol/L下，清除超氧陰離子的能力高于46.0%，槲皮素對超氧陰離子的清除能力達(dá)35.1%，在試驗(yàn)濃度的條件下，二者的清除能力還是有一定的差距，但隨著濃度的增加，槲皮素的清除能力升高更加明顯，有較好的量效關(guān)系。

2.2.5 對脂質(zhì)過氧化體系的抑制作用

依據(jù)公式（3）所得的槲皮素對脂質(zhì)過氧化體系的抑制率，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，研究比較槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，測定結(jié)果如圖7所示。

圖7 對脂質(zhì)過氧化的抑制能力Fig.7 The inhibiting activity on the lipid peroxidation

由圖7可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著槲皮素和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增大，其脂質(zhì)過氧化抑制率逐漸增強(qiáng)；槲皮素的脂質(zhì)過氧化抑制率與濃度具有良好的線性關(guān)系；當(dāng)濃度低于50 nmol/L時(shí)，槲皮素的脂質(zhì)過氧化抑制率高于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，在400 nmol/L濃度下，槲皮素脂質(zhì)過氧化抑制率為27.7%。當(dāng)濃度在50 nmol/L～400 nmol/L時(shí)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的脂質(zhì)過氧化抑制率高于槲皮素。

3 結(jié)論

采用超聲波-微波提取、大孔吸附樹脂以及Sephadex LH-20等方法制備槲皮素。并采用HPLCMS/MS鑒別所得化合物為槲皮素。通過考察槲皮素的總抗氧化活性，清除DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基以及脂質(zhì)過氧化體系中脂質(zhì)過氧化抑制率5個(gè)指標(biāo)，由此評價(jià)槲皮素的體外抗氧化活性。研究結(jié)果表明，槲皮素具有一定的抗氧化活性，相同濃度下，槲皮素清除3種自由基的能力表現(xiàn)為：清除ABTS+自由基能力最強(qiáng)，濃度在300 nmol/L～400 nmol/L時(shí)清除率達(dá)68.0%。清除DPPH自由基能力和清除超氧陰離子自由基能力基本持平，濃度在300 nmol/L～400 nmol/L，對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率為35.1%。400 nmol/L濃度下，槲皮素脂質(zhì)過氧化抑制率為27.7%。初步可得槲皮素具有一定的抗氧化活性，且有良好的量效關(guān)系。