出芽短梗霉中α-淀粉酶基因的克隆表達及生物信息學分析

劉小胖，張 寧*，李炳學

(1.沈陽農業大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110161；2.沈陽農業大學 土地與環境學院，遼寧 沈陽 110161)

淀粉酶是自然界中廣泛存在的一種水解酶類，主要應用于食品加工、醫藥、化工領域。目前，淀粉酶占世界所有酶產量的30%[1]。自然界中有許多微生物都能夠產生淀粉酶，如曲霉屬[2-3]和芽孢桿菌[4-5]。市場上的許多淀粉酶都來自于微生物的發酵生產[6]，而以枯草桿菌為工業化生產主導菌株。國外已先后從黑曲霉[7]、擔子菌酵母[8]獲得了該基因的cDNA或DNA片段并在體外進行了功能驗證。國內學者先后從地衣芽孢桿菌[9]、解淀粉酶芽孢桿菌[10]、枯草芽孢桿菌[11]和極端嗜熱厭氧古菌[12]中獲得了該酶基的cDNA或DNA片段并在體外驗證了功能。關于出芽短梗霉產淀粉酶，LEATHERS[13]研究發現，在不同的碳源上，出芽短梗霉可產生α-淀粉酶；CATHY[14]研究在出芽短梗霉中α-淀粉酶可以使普魯蘭糖的分子量和粘度降低；LINARDI等[15]研究發現，α-淀粉酶是普魯蘭多糖分子降解的主要酶類；POLLOCK等[16]研究發現，在培養后期普魯蘭糖的分子量降低，這可能是由于菌體在培養基中分泌了α-淀粉酶。MANITCHOTPISIT等[17-18]研究發現，在出芽短梗霉產普魯蘭糖的后期，α-淀粉酶可以使普魯蘭糖的分子量降低且起明顯的作用，在培養基中添加淀粉酶抑制劑可使普魯蘭多糖保持在高分子量范圍內。WANG等[19]研究發現，添加氯化鈉使出芽短梗霉產普魯蘭多糖的產量提高，但分子量降低，氯化鈉使α-淀粉酶的活性和基因的表達量均有所提高。在國內，王曉紅等[20]第1次發現出芽短梗霉也可產生α-淀粉酶；LI等[21]從海洋中分離1株出芽短梗霉可以產生淀粉酶并且可以降解生土豆淀粉[22]；李海峰等[23-24]從海洋中分離得到1株可以產淀粉酶的普魯蘭類酵母，且降解α-1,6糖苷鍵的能力很強。但早期國內外對出芽短梗霉產生淀粉酶的研究尚少[25]。出芽短梗霉是普魯蘭多糖的主要生產菌株[26]，普魯蘭多糖作為一種重要的商業化多糖，在工業、食品、醫藥等領域都有廣泛應用，但是其機理目前尚不清楚。筆者所在課題組通過研究轉錄組數據發現，在高產普魯蘭糖時α-淀粉酶基因顯著上調，推測其可能和普魯蘭多糖的合成緊密相關。因此，采用反轉錄方法結合PCR技術克隆出芽短梗霉α-淀粉酶基因并對該基因進行生物信息學分析，為以后的體外功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 出芽短梗霉NG 出芽短梗霉NG(AureobasidiumpullulansNG)由沈陽農業大學土地與環境學院微生物實驗室保存。

1.1.2 試劑 核酸Marker、加A試劑盒、pMD-18T連接試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞(保存于-80℃)；T4-連接酶、Primer Star聚合酶、RNAiso Plus試劑、限制性核酸內切酶BglII和EcoRI、實時定量反轉錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、總RNA反轉錄試劑盒、實時定量SYBR試劑盒、膠回收試劑盒(大連寶生物公司)，瓊脂糖(北京天根)，葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂(國藥集團化學試劑有限公司)，PCR引物合成與測序(上海生物工程有限公司)。

1.1.3 培養基 種子培養基[27](YND，g/L)：葡萄糖20、NaNO36.4、酵母浸粉0.2、KH2PO41.0，MgSO4·7.H2O 0.5，pH 6.0±0.5；產糖培養基[28](YPD，g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，pH6.0±0.5。以上培養基，固體培養基均加2%的瓊脂粉。

1.2 出芽短梗霉總RNA的提取及cDNA的合成

將保藏有菌株的PDA斜面放于28℃活化24 h，然后挑取菌種接于土豆培養基(PDA)平板上活化，挑取單菌落接種到YND液體培養基中，按180 r/min振蕩培養24 h成為預種子液，再以體積比1%的接種量接種到YND液體培養基，180 r/min振蕩培養24 h成為種子液。將種子液按1%的量加入到50 mL的YPD培養基中，180 r/min、28℃條件下培養3 d。參照總RNA提取試劑盒說明書提取出芽短梗霉菌齡3 d的總RNA，使用微量分光光度計Nano Drop測定所提取RNA的純度及濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的提取質量。選取提取質量較好的即具有2條明亮條帶的RNA進行反轉錄，反轉錄為cDNA后用于目的基因的克隆。

1.3 出芽短梗霉α-淀粉酶基因cDNA序列的獲得

根據轉錄組數據設計1對引物，F-BglII: 5′-GAAGATCTATGGCTTCATGGCTGCGCAG-3′、R-EcoRI: 5′-CGGAATTCTCATTGCATGGTGAACTTTC-3′。通過PCR擴增出芽短梗霉α-淀粉酶基因的ORF區(開放閱讀框)。在20 μL反應體系：cDNA模板1.0 μL，Primerstar高保真酶10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。擴增條件：94℃預變性5 min；95℃變性30 s，58.7℃退火30 s，72℃延伸2 min，34個循環；72℃再延伸10 min，12℃保存。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小正確后目的片段進行膠回收，得到出芽短梗霉α-淀粉酶基因cDNA序列，對片段進行加A反應，然后連接pMD-18T載體，16℃過夜，轉入DH5α感受態細胞中，涂布于含有Amp抗生素(50 μg/mL)的LB固體培養基上進行陽性克隆的篩選，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，將菌落PCR驗證為陽性轉化子的菌落進行擴大培養提取質粒再次進行PCR驗證，最后將菌落PCR和質粒PCR驗證均為陽性轉化子的菌液送上海生工測序。

1.4 出芽短梗霉α-淀粉酶基因的生物信息學分析

利用克隆得到的序列，比對轉錄組序列驗證PCR產物序列的正確性。利用DNAMAN推導α-淀粉酶基因的氨基酸序列。利用NCBI上的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性分析并用MEGA 5.1軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)構建α-淀粉酶基因系統發育樹[29]。利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析α-淀粉酶的基本理化性質；利用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析α-淀粉酶的信號肽剪切位點，利用S-score的值用Signal IP 4.0軟件判斷是否存在信號肽，若S-score>0.5，說明存在信號肽[30]；C-score 代表剪切位點值；Y-max score結合S和C值判斷信號肽切割位點[31]；利用Smart[32](http://smart.embl-heidilberg.de/)預測α-淀粉酶氨基酸序列的保守結構域；利用MPRED(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form．html)和TMHMM2.0[33](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)α-淀粉酶蛋白序列的跨膜區域分析；利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)進行α-淀粉酶氨基酸序列的疏水性分析，若預測結果得分大于0，且分值越大表明疏水性越強；若得分小于0，且分值越小表明親水性越強；通過OPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測α-淀粉酶氨基酸的二級結構；通過SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預測α-淀粉酶氨基酸的三級結構。

1.5 普魯蘭多糖粘度的測定

將種子液接種到YPD培養基中，從24 h開始，每隔24 h取樣1次，將菌液按5 000 r/min離心10 min，將上清置于燒杯中，加入2倍體積的無水乙醇，4℃過夜，按8 000 r/min離心10 min，將沉淀用蒸餾水重新溶解，再次加入2倍體積的無水乙醇，4℃過夜，按8 000 r/min離心10 min，將沉淀置于80℃烘箱中烘干至恒重，將多糖沉淀研磨至粉末狀，稱取一定質量的多糖溶解于去離子水中，配置成1%的多糖溶液，0.22 μm的微孔濾膜過濾，25℃下用粘度計測量其粘度變化。

1.6 普魯蘭多糖產量的測定[34]

取20 mL的菌液5 000 r/min離心10 min，取上清液10 mL加入2倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加水重溶，再次加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀，將沉淀于80℃烘干至恒重。每組重復3次。

1.7 出芽短梗霉中α-淀粉酶基因表達的分析

將出芽短梗霉的種子液以1%接種量加入到50 mL的YPD培養基中，從24 h開始，每隔12 h取樣1次，至108 h止。利用RNAiso Plus試劑提取出芽短梗霉的總RNA[35]，并利用實時定量反轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄成cDNA，操作方法參照試劑盒說明書。18S作為內參基因，使用的儀器是美國伯樂公司的CFX ConnectTM熒光定量PCR儀。基因的相對表達量公式為R=2-ΔΔCt。結果進行單因素方差分析(ANOVA )[36]，T檢驗比較數據間的差異是否顯著(P<0.05認為具有顯著性差異)，每個樣品重復3次。利用Primer 5.0設計引物(表1)，并由上海生物工程公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of PCR primers

2 結果與分析

2.1 出芽短梗霉總RNA的提取

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的提取效果(圖1)，結果有18S rRNA和28S rRNA 2條清晰的條帶，說明提取的總RNA純度較高，可以滿足后續試驗的要求。

圖1 出芽短梗霉總RNAFig.1 Total RNA extracted from A.pullulans

2.2 出芽短梗霉α-淀粉酶基因全長cDNA的克隆

通過F-BglII、R-EcoRI在出芽短梗霉cDNA上，成功克隆了出芽短梗霉α-淀粉酶基因全長cDNA序列，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物條帶單一明亮(圖2)，表明引物特異性強，可以進行條帶膠回收并進行下一步試驗。

2.3 出芽短梗霉中α-淀粉酶基因的生物信息

2.3.1 系統發育樹 利用NCBI 上的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得大量與出芽短梗霉α-淀粉酶氨基酸序列的同源序列，但在進行Blast時發現，其與其他菌α-淀粉酶的同源性為50%～60%，卻與glucan 1,4-alpha-maltohexaosidase precursor(登錄KEQ67332.1)有極高的相似性，進化樹上也與其親緣關系較近(圖3)。

注：M為2 000 的marker; 1為CK ;2～3 為α-淀粉酶基因。Note: M, marker DL 2 000; 1, CK; 2～3, α-amylase gene.圖2 出芽短梗霉α-淀粉酶基因全長克隆Fig.2 Full-length cloning of α-amylase gene from A.pullulans

注：進化樹分支置信度檢測利用 Bootstrap 進行(1 000次)，分支上數值表示置信度。Note: The confidence of cladogram’ branches is tested by bootstrap analyses ( 1 000 replicates).The value on the branch indicates the confidence.圖3 α-淀粉酶蛋白的氨基酸序列構建的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of α-amylase protein from A.pullulans

2.3.2α-淀粉酶蛋白潛在的信號肽切割位點 由圖4表明，在出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的氨基酸序列中沒有信號肽剪切位點。

2.3.3α-淀粉酶理化性質 該蛋白具有563個氨基酸，分子量為63 318.63 Da，理論等電點(pI)為7.24；在組成出芽短梗霉中α-淀粉酶的20種氨基酸當中，丙氨酸(Ala)含量占比最高，達8.7%；而半胱氨酸(Cys)含量最低，為1.4%；帶負電荷氨基酸殘基數(天冬氨酸和谷氨酸)有67個，帶正電荷氨基酸殘基數(精氨酸和賴氨酸)也有67個。出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼多肽的原子組成為C2845H4317N789O817S21，原子總數為8 789，消光系數在280 nm下為157 830。出芽短梗霉中α-淀粉酶的不穩定系數為32.24，由此說明該蛋白是穩定的蛋白。預測該蛋白的脂肪系數為68.97，α-淀粉酶的總平均親水性為-0.490，說明該蛋白為親水性的蛋白。

圖4 α-淀粉酶信號肽的酶切位點Fig.4 Restriction enzyme cutting sites of α-amylase signal peptide

2.3.4α-淀粉酶親疏水性 如圖5所示，蛋白質的跨膜區域大多數由約20個疏水性氨基酸殘基組成的α螺旋結構。該氨基酸序列內含有較多的親水性結構域，表明出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼蛋白可能為親水性蛋白。結合出芽短梗霉中α-淀粉酶的親/疏水性、脂肪系數與總平均親水性來綜合分析，由此可以判定α-淀粉酶是親水性蛋白，這與CATLEY[14]研究發現在培養基上清中α-淀粉酶可以使普魯蘭多糖分子量降低一致，說明在菌體內α-淀粉酶是分泌蛋白，此預測與體內的結果一致。

出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的氨基酸疏水性較差(圖5)，不存在典型的強疏水性結構域，從而可判斷α-淀粉酶基因編碼的蛋白質不存在跨膜區域，即出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的蛋白質不是跨膜蛋白。

2.3.5α-淀粉酶跨膜螺旋結構 由圖6A可見，α-淀粉酶基因編碼的蛋白質含有多個跨膜螺旋區域，其中由外向內有4個跨膜螺旋區域，這4個螺旋區域相應的氨基酸位置為第65～86個(分數683)、第130～148個(分數59)、第419～438個(分數104)、第482～501個(分數613)，由內向外有2個跨膜螺旋區域，其相應的氨基酸位置為第65～86個(分數340)、第478～501個(分數683)。評分大于500認為是可能的跨膜區域[37]。綜合內外雙向的分析，α-淀粉酶無跨膜區域。此外，由圖6B可見，出芽短梗霉中α-淀粉酶基因編碼的蛋白質無跨膜結構域，整段序列均位于質膜的外側。2種在線軟件的預測結果一致，說明α-淀粉酶基因編碼的蛋白質無跨膜結構域，進一步證明通過疏水性分布圖(圖5)判斷蛋白質跨膜區的可靠性，預測結果表明，α-淀粉酶基因編碼的蛋白質不是內在膜蛋白，而很有可能是可溶性蛋白。

圖5 α-淀粉酶編碼的氨基酸疏水性Fig.5 Hydrophobicity of α-amylase amino acids

圖6 α-淀粉酶的跨膜區域Fig.6 Transmembrane domains of α-amylase

2.3.6α-淀粉酶的保守結構域 由圖7和表2可見，在47～453個氨基酸存在淀粉酶結構域。

圖7 α-淀粉酶的保守結構域預測Fig.7 Prediction for conserved domain of α-amylase

表2 α-淀粉酶基因上的其他保守結構域Table 2 Other conserved domains in α-amylase gene

2.3.7α-淀粉酶蛋白的二級結構 如圖8所示，α-淀粉酶蛋白的二級結構組成中，h占27.35%，e占20.60%，t占4.62%，c占47.42%。由此可推測，出芽短梗霉中α-淀粉酶含有大量無規則卷曲和α-螺旋結構元件，而結構元件延伸鏈和β-轉角則散布于整個蛋白質中。

注：h代表α-螺旋、t代表β-轉角、e代表延伸鏈、c代表無規則卷曲。Note: h, α-helix; t, β-turn; e, extended strand; c, random coil.圖8 α-淀粉酶的二級結構Fig.8 Secondary structure of α-amylase

2.3.8α-淀粉酶結構域的三級結構 經SWISS-MODEL預測，三級結構中無復雜的螺旋結構(圖9)。

圖9 α-淀粉酶蛋白結構域的三級結構Fig.9 Tertiary structure of α-amylase protein structural domain

2.4 α-淀粉酶基因的氨基酸序列

由圖10可見，α-淀粉酶基因全長cDNA 序列為1 782 bp，開放閱讀框區域含有1 692 bp，共編碼563個氨基酸。

注：圖中陰影部分是α-淀粉酶功能區。Note: The shaded area is the functional zone of α-amylase.圖 10 α-淀粉酶基因的氨基酸序列Fig.10 Amino acid sequence of α-amylase gene

2.5 普魯蘭多糖的粘度

一般情況下，高分子溶液的粘度變化，一方面是由于其分子量變化，而導致粘度變化，普魯蘭多糖的分子量和粘度在一定條件下呈相關性 。從圖11看出，隨著普魯蘭多糖粘度的降低，普魯蘭多糖的分子量亦逐漸降低。

圖 11 普魯蘭多糖粘度的變化規律Fig.11 Change rule of pullulan viscosity

2.6 普魯蘭多糖的產量

如圖12所示，普魯蘭多糖的產量一直增加，第108 h時普魯蘭多糖產量達到最高。

圖 12 普蘭多糖產量的變化規律Fig.12 Change rule of pullulan yield

2.7 α-淀粉酶基因的實時定量分析

如圖13所示，α-淀粉酶基因在出芽短梗霉各個階段中均有表達，α-淀粉酶基因在出芽短梗霉培養的不同時間存在表達特異性，其中108 h的表達量最高且遠高于前期的表達量。這與前人研究的結果相吻合[17]，普魯蘭糖在發酵后期分子量降低[38]，由此可推斷出芽短梗霉中α-淀粉酶基因可能參與了普魯蘭糖分子量降解這一生物學過程。這與生物信息學分析的出芽短梗霉中α-淀粉酶非膜蛋白相吻合。

圖 13 不同時間段α-淀粉酶基因的相對表達量Fig.13 Relative expression of α-amylase gene in different time periods

3 結論與討論

該試驗采用反轉錄PCR結合普通PCR技術從出芽短梗霉克隆得到α-淀粉酶基因，生物信息學分析表明，其全長1 782 bp，包括1 692 bp編碼區序列，該基因編碼的蛋白含有563個氨基酸。多種軟件預測分析表明，該蛋白是親水性蛋白，分子量約為63.32 kDa，理論等電點(pI)為7.24；無信號肽剪切位點，無明顯的跨膜螺旋拓撲結構，二級結構主要以無規則卷曲為主，占47.42%。基因表達分析表明，α-淀粉酶基因在各個時期均有表達，在108 h表達量最高。該基因具有α-淀粉酶結構域，但在進行Blast時發現，與其他菌α-淀粉酶的同源性為50%～60%，卻與glucan 1,4-alpha-maltohexaosidase precursor(登錄KEQ67332.1)有極高的相似性，進化樹上也與其親緣關系較近。

該研究雖然對出芽短梗霉中α-淀粉酶基因進行了克隆、生物信息學分析及基因表達分析，但其實際結構和功能還有待進一步驗證。α-淀粉酶基因結構簡單而且是親水蛋白，這為體外克隆表達此蛋白奠定了理論基礎。由于淀粉酶在實踐中的重要性，組建α-淀粉酶高產菌株已成為基因工程研究中的重要課題，國內外關于這方面的研究自20世紀80年代以來進展較快。解淀粉芽孢桿菌[39]、枯草芽孢桿菌[40]、地衣芽孢桿菌[41]、黑曲霉[7]等的α-淀粉酶基因已相繼被克隆，并在大腸桿菌或枯草桿菌中得到表達。目前關于出芽短梗霉中α-淀粉酶的體外克隆表達尚未有報道，MANITCHOTPISIT等[42]分析的出芽短梗霉中淀粉酶基因與該菌株中的α-淀粉酶基因序列相差甚大，故有待于進一步驗證其功能。LIU等[42]利用基因敲除等手段研究Aureobasidium melanogenum P16 發現，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異普魯蘭酶決定了普魯蘭多糖的分子量。目前關于出芽短梗霉中α-淀粉酶的研究主要集中在酶活性上，但機理研究卻很少，故下一步欲利用分子生物學手段，將其克隆到表達載體上進行體外的功能驗證，為后續的體內功能驗證奠定基礎。

有研究發現，α-淀粉酶在普魯蘭分子量降低過程中發揮著重要作用[17-18]。在整個搖床培養過程中，普魯蘭多糖的粘度一直在降低，但普魯蘭多糖的產量卻一直升高，α-淀粉酶的基因在108 h的搖床培養過程中一直表達。LIU等[42]研究發現，將α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異普魯蘭酶其中任何一個基因敲除或將3個基因都敲除，普魯蘭分子量升高但產量降低。土地與環境學院微生物實驗室在進行轉錄組數據分析時發現，在高產普魯蘭多糖時，在淀粉和蔗糖代謝途徑中糖代謝相關基因僅有α-淀粉酶的表達量顯著上調，推測α-淀粉酶在普魯蘭糖的合成過程中發揮著重要作用，但也待進一步探索，這可能對揭示普魯蘭多糖的合成機理發揮重大作用。