地錦褐斑病病原菌鑒定及病害診斷

吳石平, 莫硯成, 饒 岸

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 貴州省植物保護(hù)研究所,貴州 貴陽 550006；2.北京師范大學(xué)貴陽附屬中學(xué),貴州 貴陽 550081)

地錦(ParthenocissustricuspidataPlanch)是一種重要的綠籬植物，常攀緣在墻壁、圍墻、道路音障墻等處，在生態(tài)文明建設(shè)和城市美化上發(fā)揮著重要作用，是城市綠化不可缺少的景觀植物。近年，一種褐斑病在地錦上普遍發(fā)生，病害發(fā)生后在葉片形成大量的褐色病斑，極大影響了其綠化效果和生態(tài)功能。目前未見該病原鑒定和診斷方面的報道。為了明確褐斑病病原，對今后該病的深入研究及防治提供理論支撐，對其病病原菌進(jìn)行了分離鑒定及病害診斷。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的采集

在地錦褐斑病發(fā)病盛期采集癥狀典型的病葉標(biāo)本，采集地點(diǎn)為貴陽市藥用植物園及貴州省植物園。

1.2 菌株的分離及培養(yǎng)

選取典型病斑，在顯微鏡下挑取分生孢子器，放入無菌水中壓碎，制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液涂到水瓊脂(WA)平板上。2 d后逐日檢查孢子萌發(fā)情況，待孢子萌發(fā)后，挑取單個萌發(fā)的孢子接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃避光培養(yǎng)。

1.3 病原菌的驗(yàn)證

參照《植病研究方法》[1]，采用科赫氏法則驗(yàn)證分離到的菌株是否為該病病原菌。

1.4 形態(tài)觀察

將分離純化的菌株用直徑8 cm的滅菌打孔器，從菌落邊緣打塊，將含有生長旺盛的菌絲的PDA小塊。接入PDA平板中央。每菌株5個重復(fù)。于28℃培養(yǎng)。第10天時測量菌落直徑，觀察菌落形態(tài)；然后挑取分生孢子器制片，在顯微鏡下觀察分生孢子器、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子的形態(tài)和大小。

1.5 分子系統(tǒng)學(xué)研究

參照Cubero[2]的方法提取菌株的總DNA。采用多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增核糖體RNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因、延伸因子(TEF)、肌動蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GPDH)[3]，PCR產(chǎn)物由北京諾塞基因有限公司進(jìn)行測序。采用MAFFT[4]對各菌株的4個基因序列以及在GenBank下載的相關(guān)的序列進(jìn)行比對。為實(shí)現(xiàn)排序匹配的最優(yōu)化，用手工校正。然后將4個基因的序列進(jìn)行拼接，采用GBlocks刪除不可靠的序列信息；采用PAUP4.0 beta 10[5]軟件以最大簡約法(Maximum parsimony,MP)進(jìn)行分析，采用RaxmlGUI以最大似然法(maximum likelihood,ML)[6]構(gòu)建系統(tǒng)樹，選取結(jié)構(gòu)較為合理的系統(tǒng)樹，將ML和MP自舉得到的分支支持率標(biāo)記在系統(tǒng)樹上。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

通過對貴州省藥用植物園和貴州省植物園采集到的標(biāo)本進(jìn)行分離和純化，共分離到GZCC6.1728、GZCC6.1729、GZCC6.1730和GZCC6.1731菌株，4菌株的菌落生長速度、色澤、分生孢子器、孢子形態(tài)等一致。

2.2 科赫氏驗(yàn)證

選取菌株GZCC6.1728的孢子懸浮液，接種到幼嫩的地錦葉片上，5 d后葉片上形成明顯的褐色病斑與采集到的標(biāo)本基本一致，無菌水對照未出現(xiàn)病斑。10 d后病斑上開始出現(xiàn)分生孢子器，15 d后在接種的病葉上挑取分生孢子器，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)分生孢子器、分生孢子與出發(fā)菌株的分生孢子器及分生孢子形態(tài)上一致，分離長出的菌落得到菌株GZCC6.1732，該菌株與接種菌株GZCC6.1728生長速度、菌落形態(tài)和顏色一致，對ITS、TEF、ACT和GPDH 4個基因測序比對結(jié)果顯示，2菌株的4個基因序列完全一致。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 病斑上病原菌分生孢子器形態(tài)球形或扁球形，130～280 μm，埋生或半埋生，分生孢子梨形到長橢圓形，(6～9.5)μm×(9～13)μm，單孢，無色，透明，內(nèi)含油滴，表面隆起，有膠質(zhì)鞘包圍，尾部有附屬絲，有時孢子沒有膠質(zhì)鞘包圍和附屬絲。

注：A 葉片病斑，B 葉背癥狀，C 病斑放大(示分生孢子器)，D、 E為分生孢子器切片，F(xiàn)分生孢子，G分生孢子在水瓊脂上萌發(fā)，H菌落正面，I菌落反面。Note:A,leaf spots; B,symptoms of blade back ; C,disease spots after amplification(Pycnidium); D,E,section of pycnidium; F,conidia; G,conidia on water agar; H,face of colony; I,back of colony.圖1 地錦葉斑病葉片癥狀及病原菌Fig.1 symptoms and pathogen with leaves of Brown Patch of P.tricuspidata

PDA培養(yǎng)基上的菌落圓形，邊緣花瓣狀，氣生菌絲絨狀；菌落正面青灰色至黑色，有葉點(diǎn)霉屬真菌特有的金屬光澤，背面黑色。在生長后期菌落上形成分生孢子器，散生于菌落中，分生孢子器深褐色至黑色，球形、扁球形或管狀，105～280 μm，產(chǎn)孢細(xì)胞(3～7)μm×(3.5～15)μm，分生孢子卵圓形至長橢圓形(5.5～9)μm×(8～14)μm，單孢，無色，透明，內(nèi)含油滴，表面隆起，有膠質(zhì)鞘包圍，尾部有附屬絲，該菌在形態(tài)上與地錦葉點(diǎn)霉形態(tài)基本一致(圖1)。

2.3.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析 將分離到的4個菌株和科赫氏驗(yàn)證分離到的1個菌株及近緣種12個菌株及外群BotryosphaeriaobtusaCMW8232共18個菌株的ITS、ACT、EF和GPDH 4個基因?qū)R連接后，序列總位點(diǎn)數(shù)為1 503個，其中保守位點(diǎn)為1 062個，無簡約信息位點(diǎn)282個，最大簡約信息位點(diǎn)數(shù)159個，運(yùn)用PAUP軟件采用最大簡約法分析得到系統(tǒng)樹，該樹長(Tree length)、一致性指數(shù) (CI)、同型指數(shù)(HI)、保留指數(shù) (RI)、重標(biāo)定指數(shù)(RC) 分別為645、0.798 4、0.201 6、0.746 7和0.596 9，參與構(gòu)建系統(tǒng)樹的近緣種均以較高的支持率形成分支。

注：分支上的數(shù)值為最簡約樹的自舉支持率(MPBS)和最大似然法的自舉支持率(MLBS)，未標(biāo)注表示自舉支持率小于50%，加“*”的菌株為模式菌株。Note:Values of every branch were MPBS and MLBS,and nothing of every branch were less than 50%.Names of strain with * were the type strains.圖2 地錦褐斑病病原菌及近緣種菌株多基因分子系統(tǒng)樹Fig.2 Pathogen of brown patch of P.tricuspidata and polygene molecular phylogenetic tree of Strain with relative species

從地錦病斑上分離到的4個菌株(GZCC 6.172 8、GZCC 6.172 9、GZCC 6.173 0)GZCC 6.173 1)，以及回接發(fā)病后的病斑上分離到的菌株(GZCC 6.173 2)均與地錦葉點(diǎn)霉(P.partricuspidatae)聚在一支，最簡約法(MP)和最大似然法(ML)的自舉支持率均為100%，該分支與近緣種以較高的支持率與P.parthenocissi構(gòu)成姊妹支(圖2)。

3 結(jié)論與討論

地錦(ParthenocissustricuspidataPlanch)是一種重要的綠籬植物，也稱為爬山虎，我國大部分省區(qū)均有分布。該植物抗病性較強(qiáng)，報道的病害較少。高國平等[7-11]報道了地錦葉斑病的病原菌為馬卡假尾孢(PseudocercosporamacadamiaeDeighton)；Gullino等[8]報道了由Cercosporaampelopsidis、Passalorabougainvilleae、Passaloradubia等病原菌引起的地錦葉斑病，但未見地錦褐斑病的報道。蔡祝南等[12-14]等描述了爬山虎葉斑病病原菌為常春藤葉點(diǎn)霉(P.hedericola)，經(jīng)比較，地錦褐斑病病原菌孢子較大，病斑顏色較深，癥狀有差異。同時，常春藤葉點(diǎn)霉(P.hedericola)目前分類地位不屬于葉點(diǎn)霉屬真菌[15]。邱寧宏等[16]鑒定了爬山虎葉斑病病原菌為爬山虎葉點(diǎn)霉(P.allescher)，該菌與本研究的差異較大，不是同一種病害。

通過對病斑癥狀觀察和發(fā)生流行分析發(fā)現(xiàn)，地錦褐斑病有明顯的擴(kuò)展過程，發(fā)病程度輕重有差異，發(fā)生期較長，發(fā)病過程由輕到重；發(fā)病范圍廣，病健部分界明顯，病斑上有小黑點(diǎn)，為真菌的分生孢子器，內(nèi)有大量葉點(diǎn)霉屬真菌孢子。通過科赫氏法則，證實(shí)了該菌為引起病害的病原菌。該病的主要特征為：病斑圓形或不規(guī)則形，3～20 mm,病部植物組織壞死，病斑正面中央淺褐色至黃褐色，邊緣深褐色；散生或輪生小黑點(diǎn)(分生孢子器))；病斑背面與正面色澤一致，也能產(chǎn)生分生孢子器，嚴(yán)重時多個病斑愈合形成大斑。

從室外病葉和科赫氏驗(yàn)證分離到的菌株，在分生孢子器、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子的大小和形態(tài)、菌落形態(tài)和生長習(xí)性等方面的特征，與地錦葉點(diǎn)霉相符合，分子系統(tǒng)學(xué)研究表明分離到的菌株與地錦葉點(diǎn)霉聚為一支。因此，引起地錦褐斑病的病原菌鑒定為地錦葉點(diǎn)霉(P.partricuspidatae)。