大禿馬勃培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

史 鑫，王宏杰，王鴻磊，丁 強(qiáng)，王紅艷

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264670)

大禿馬勃(Calvatiagigantea)又名馬糞包，大馬勃，屬真菌界擔(dān)子菌門(mén)傘菌綱傘菌科禿馬勃屬真菌[1-3]。子實(shí)體近球形至球形，直徑15～36 cm或更大，不孕基部無(wú)或很小，常單生或群生于草地上，我國(guó)東北、華東及西南等地均有分布[4-6]。大禿馬勃子實(shí)體幼時(shí)白色，可以食用，味道鮮美，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)31.27%，遠(yuǎn)高于香菇、金針菇和平菇等食用菌，且含有豐富的礦物質(zhì)，是一種珍稀的食用真菌[7-8]。大禿馬勃也是一種重要的藥用真菌，具有清熱解毒、抗炎止血及抗癌抗腫瘤等功效[9-14]，其藥用價(jià)值在《本草綱目》中有記載，在《中國(guó)藥典》(2005 版)中被列為3種正品馬勃之一[15]。

大禿馬勃是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的食藥用真菌，但目前仍然靠人工采摘野生資源為主，遠(yuǎn)不能滿足其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的需要，發(fā)展大禿馬勃人工栽培勢(shì)在必行。目前，大禿馬勃的研究主要集中在抗腫瘤[16]、抗氧化[17]等生藥學(xué)方面和菌絲液體發(fā)酵[18]方面，對(duì)人工栽培的研究也僅限于仿野生栽培[19]，其生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，尚沒(méi)有工廠化栽培的記錄。筆者所在課題組自野外采集到野生大禿馬勃1株，計(jì)劃對(duì)其生物學(xué)性質(zhì)、種子制備、栽培方法等進(jìn)行系統(tǒng)研究，以實(shí)現(xiàn)大禿馬勃的工廠化栽培。前期研究發(fā)現(xiàn)，大禿馬勃菌絲在普通PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，其生長(zhǎng)速度為1.179 4 mm/d，導(dǎo)致人工培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)(>20 d)。鑒于此，利用響應(yīng)面法對(duì)大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，旨在為縮短大禿馬勃菌種培養(yǎng)時(shí)間，提高其菌絲生長(zhǎng)速率并實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 大禿馬勃菌種 分離保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院微生物研究室。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基(土豆浸粉6 g,KH2PO42.0 g,MgSO40.5 g,瓊脂20 g，水1 000 mL)，自制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將大禿馬勃菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上，在24℃恒溫避光培養(yǎng)20 d，用Φ5 mm打孔器打取菌絲塊備用。

1.2.2 不同因素對(duì)大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響

1) 最佳碳源。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加20 g/L的葡萄糖、蔗糖、紅糖和可溶性淀粉。將大禿馬勃菌絲塊接種于碳源篩選培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理接種1塊，6次重復(fù)，24℃培養(yǎng)，從第9天開(kāi)始，每2 d測(cè)量1次菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)量。以菌絲生長(zhǎng)量最大、菌絲最為濃密的碳源為最佳碳源。

菌絲生長(zhǎng)量=(菌落直徑-菌絲塊直徑)/2

2) 最佳氮源。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，在最佳碳源培養(yǎng)基中分別添加5 g/L的蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、豆餅粉及黃豆粉。將大禿馬勃菌絲塊接種于氮源篩選培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理接種1塊，6次重復(fù)，24℃培養(yǎng)，從第8天開(kāi)始，每2 d測(cè)量1次菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)量。以菌絲生長(zhǎng)量最大、菌絲最為濃密的氮源為最佳氮源。

3) 淀粉濃度。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，即在5 g/L豆餅粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養(yǎng)基中分別添加10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L及30 g/L淀粉。每個(gè)處理接種1塊，6次重復(fù)，24℃培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，當(dāng)有1個(gè)平板的菌絲長(zhǎng)到接近9 cm培養(yǎng)皿邊緣時(shí)試驗(yàn)結(jié)束(下同)，開(kāi)始測(cè)量菌絲生長(zhǎng)量，記錄培養(yǎng)時(shí)間，確定最佳淀粉濃度。

4) 豆餅粉濃度。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，即在15 g/L淀粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養(yǎng)基中分別添加1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L和9 g/L豆餅粉。每個(gè)處理接種1塊，6次重復(fù)，24℃培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，記錄培養(yǎng)時(shí)間，確定最佳豆餅粉濃度。

5)土豆浸粉濃度。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，即在15 g/L淀粉+7 g/L豆餅粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養(yǎng)基中分別添加2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L土豆浸粉。每個(gè)處理接種1塊，6次重復(fù)，24℃培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，記錄培養(yǎng)時(shí)間，確定最佳土豆浸粉濃度。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基配方 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定影響大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)的試驗(yàn)因素，選擇豆餅粉(A)、淀粉(B)和土豆浸粉(C)3個(gè)因素為自變量，以菌絲生長(zhǎng)量為響應(yīng)值(Y)，采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法篩選大禿馬勃培養(yǎng)基最優(yōu)配方；通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸和方差分析，根據(jù)模型方程繪制大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)響應(yīng)面曲面圖及等高線，并根據(jù)響應(yīng)面曲線的陡峭程度及效應(yīng)面的等高線形狀確定最優(yōu)配方組合。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 13.0和Origin 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，利用Design-Expert 7.1.3進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素處理大禿馬勃菌絲的生長(zhǎng)量

從圖1可見(jiàn)，不同碳源、氮源和不同濃度的淀粉、土豆浸粉和豆餅粉對(duì)大禿馬勃菌絲的生長(zhǎng)有不同程度的影響。

2.1.1 碳源 大禿馬勃菌絲在以淀粉和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)至第17天時(shí)部分平板的菌絲已接近培養(yǎng)皿邊緣，二者平均菌絲生長(zhǎng)量相當(dāng)，分別為2.931 cm和2.795 cm，但以淀粉為碳源培養(yǎng)的大禿馬勃菌絲密度更大，所以選擇淀粉為培養(yǎng)大禿馬勃菌絲的最佳碳源。

2.1.2 氮源 大禿馬勃菌絲在以豆餅粉和黃豆粉為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)至第18天時(shí)，以豆餅粉為氮源培養(yǎng)的大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)量和菌絲密度均最大，其生長(zhǎng)量為2.703 cm，所以選擇豆餅粉為培養(yǎng)大禿馬勃菌絲的最佳氮源。

2.1.3 淀粉 隨著淀粉濃度增大，大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)量呈先升后降趨勢(shì)。其中，當(dāng)?shù)矸蹪舛葹?5 g/L時(shí)菌絲生長(zhǎng)量達(dá)最大，為3.371 cm；繼續(xù)增大淀粉濃度則菌絲生長(zhǎng)量反而下降。因此，最佳淀粉濃度以15 g/L為宜。

2.1.4 土豆浸粉 土豆浸粉對(duì)大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響趨勢(shì)與淀粉的基本相同，也呈先升后降趨勢(shì)。即隨著土豆浸粉濃度增大大禿馬勃菌絲的生長(zhǎng)量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)濃度為6 g/L時(shí)菌絲生長(zhǎng)量達(dá)最大，為3.386 cm；濃度繼續(xù)增大則菌絲生長(zhǎng)量下降。因此，最佳土豆浸粉濃度以6 g/L為宜。

2.1.5 豆餅粉 豆餅粉對(duì)大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響趨勢(shì)與淀粉和土豆浸粉基本相同，亦呈先升后降趨勢(shì)。當(dāng)豆餅粉濃度為1～7 g/L時(shí)大禿馬勃菌絲的生長(zhǎng)量呈上升趨勢(shì)，并在濃度為7 g/L時(shí)達(dá)最大，為3.803 cm；繼續(xù)增大豆餅粉濃度則菌絲生長(zhǎng)量下降。因此，豆餅粉濃度以7 g/L最佳。

圖1 不同因素處理大禿馬勃菌絲的生長(zhǎng)量Fig.1 Effect of different factors on mycelia growth of C.gigantean

2.2 大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基的最優(yōu)配方

從表1可見(jiàn)，處理4的菌絲生長(zhǎng)量最大，為3.925 cm，其次是處理9和處理5，分別為3.890 cm和3.875 cm；處理1最小，為2.905 cm。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸得二項(xiàng)式擬合方程為各處理菌絲生長(zhǎng)量(Y)進(jìn)行二次回歸擬合，得方程Y=-0.38+0.34A+0.32B+0.29C+0.05AB+0.02AC+0.002 5BC-0.08A2-0.025B2-0.04C2。其中，模型P=0.002 3(<0.01)，擬合不足P=0.163 9(>0.05)，R2=0.934 2，說(shuō)明，通過(guò)響應(yīng)面法擬合所得二次回歸模型與實(shí)際值擬合度高，模型回歸達(dá)極顯著，模型與試驗(yàn)各因素相關(guān)度好，試驗(yàn)方法可靠且誤差小，能夠很好地分析和預(yù)測(cè)大禿馬勃菌絲的生長(zhǎng)量。豆餅粉的二次項(xiàng)(A2)及豆餅粉與淀粉的交互作用(AB)的P值分別為0.000 3和0.006 0，均<0.01，說(shuō)明，二者對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響達(dá)極顯著水平；豆餅粉(A)、淀粉(B)及土豆浸粉二次項(xiàng)(C2)的P值分別為0.013 1、0.034 5和0.015 0，均<0.05，說(shuō)明，三者對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的影響達(dá)顯著水平；各因素對(duì)大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)量的影響依次為A2>AB>A>C2>B>B2>C>AC>BC。

表1 大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基配方的響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 1 The scheme and results of the response surface experiment for optimizing medium formula in mycelia growth of C.gigantean

從圖2可知，3個(gè)響應(yīng)面均為開(kāi)口向下的凸形曲面，說(shuō)明，響應(yīng)值存在極高值。響應(yīng)曲面的等高線中心均位于-1～1，說(shuō)明，菌絲生長(zhǎng)的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)。3組交互效應(yīng)的等高線形狀均為橢圓形，表示各因素的交互作用顯著。由此確定大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基的最佳配方為2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂+7.10 g/L豆餅粉+14.11 g/L淀粉+6.00 g/L土豆浸粉，在此條件下菌絲生長(zhǎng)量預(yù)計(jì)最大可達(dá)3.87 cm。根據(jù)最佳配方配制培養(yǎng)基對(duì)模型進(jìn)行3次以上驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果表明，菌絲培養(yǎng)時(shí)間為11 d時(shí)平均菌絲生長(zhǎng)量達(dá)3.795 cm，與預(yù)測(cè)值相比誤差為1.94%。說(shuō)明，該試驗(yàn)建立的因素與響應(yīng)值的回歸模型科學(xué)合理，可以較好地預(yù)測(cè)大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)量。優(yōu)化后大禿馬勃菌絲的生長(zhǎng)速度為3.45 mm/d，為優(yōu)化前的2.93倍，極大地提高了大禿馬勃的培養(yǎng)效率。

圖2 不同因素下大禿馬勃菌絲生長(zhǎng)量的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface and contour line of mycelia growth of C.gigantean under different factors

3 結(jié)論與討論

大禿馬勃是一種珍稀的食藥用真菌，具有廣闊的食品和醫(yī)藥開(kāi)發(fā)價(jià)值[20-21]。由于野生資源有限，人工栽培是大禿馬勃開(kāi)發(fā)的必由之路。研究結(jié)果表明，大禿馬勃菌絲培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為豆餅粉7.10 g/L、淀粉14.11 g/L、土豆浸粉6.00 g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO40.5 g/L及瓊脂20 g/L。此條件下菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)3.45 mm/d，培養(yǎng)時(shí)間縮短至11 d，平均菌絲生長(zhǎng)量達(dá)3.795 cm。