厚樸葉過氧化物酶對水體中壬基酚的去除效果

王雨雪，趙廣華，張小萌，唐 密，吳水涵，肖 強，*

(1.湖北民族學院, 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院 林學園藝學院，湖北 恩施 445000)

壬基酚(Nonylphenol，NP)是一種可以通過皮膚被人體吸收，破壞人體生殖、免疫系統的環境有害因子[1-3]，具有親脂性、難降解性、生物富集性和雌激素活性，亦可通過食物鏈進入人體甚至轉移給胎兒[4-6]。NP主要由非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)降解產生[7-8]。清除環境殘余NP的方法較多：電極催化法和光電催化法[9-10]高效廉價[11]，但工序復雜；粉末活性炭吸附法可富集[12]但并不能徹底去除目標物；氧化錳材料催化臭氧氧化去除酚類污染物效率高但會帶來二次(臭氧)污染[13]；微生物去除法綠色無污染[14]，但污水環境中的微生物生存能力較低。

過氧化物酶(Peroxidase，POD)催化氧化法高效、綠色且經濟，其以H2O2為電子受體，可催化H2O2產生羥基自由基，從而對酚類物質產生過氧化反應[15]。過氧化物酶廣泛應用于醫療診斷、廢物脫色、酚、苯胺類污水處理等領域[16]。KLIBANOV等[17]最早采用過氧化物酶去除廢水中的酚類和芳香胺類化合物，并將其用于含酚廢水的脫色，過氧化物酶對底物的氧化是高度非特異的，這使得利用過氧化物酶結合H2O2催化氧化去除NP等酚類化合物成為可能[18]。

厚樸(MagnoliaofficinalisRehd.et Wils)作為道地藥材主產于四川和湖北恩施等地[19]。洪健等[20]研究發現，在15～80℃，厚樸過氧化物酶活性隨著溫度的升高而升高，熱穩定性較好，具有較寬的溫度適應范圍。利用初步純化后的厚樸過氧化物酶作為催化劑，與H2O2結合形成厚樸過氧化物酶-H2O2體系用于降解NP廢水，考察不同條件下該體系對NP的去除效果發現，該體系在催化NP降解方面具有綠色環保、操作簡單、費用低和效率高等優點。同時可以實現大量厚樸葉片資源的綜合利用，提高種植戶經濟收益，達到保護環境、促進生態文明建設的目的。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 厚樸 6年生厚樸成熟無病蟲害樹葉，采自湖北民族學院植物園，經湖北民族學院林學園藝學院鑒定為厚樸。

1.1.2 試劑 乙二胺四乙酸，天津市福晨化學試劑廠；硫酸銨、PEG4000和牛血清蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鋇、吐溫80和氯化鈉，上海生工生物有限工程公司；愈創木酚，BIO BASIC INC；壬基酚和腐殖酸，上海源葉生物科技有限公司；富里酸，酷爾化學科技(北京)有限公司；檸檬酸、乙酸、硼酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮-K30、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、30% H2O2、無水甲醇及十二水合硫酸鋁鉀，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備 電子分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；超聲細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，邦西儀器科技有限公司；冷凍干燥機為德國Christ ALPHA 2-4 LSC；高效液相色譜-飛行時間質譜儀，Agilent科技有限公司；試驗用水為超純水，USA；KQ5200E型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1酶的制備

1) 粗酶液。取厚樸樹葉去除主脈并剪碎，稱取1 000 g，加入3 000 mL預凍的含5% PVP-K30(聚乙烯吡咯烷酮-K30)和2 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的冰水混合磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)，4℃勻漿，用4層紗布過濾后4℃下攪拌2 h后再8 480 r/min離心，上清液保留，配制含1%(w/v)吐溫80、1 mol/L NaCl溶液，按1∶3料液比提取濾渣中的結合態過氧化物酶(Bound Peroxidase，BPOD)，4℃攪拌2 h，4℃下8 480 r/min離心，濾渣丟棄，合并兩次所得上清液，即為粗酶液，置于4℃冰箱保存。

2) 部分純化酶。粗酶液經20%飽和度硫酸銨沉淀，除去多糖等雜質，離心，取上清液，繼續加硫酸銨分級沉淀合并50%～95%飽和度部分，以純水溶解后，按質量百分比15%硫酸銨(W/V)-20%PEG4000(W/V)進行雙水相萃取，靜置2 h，下相4℃純水透析除鹽，期間不斷更換純水，直至透析液用1% BaCl2檢測無沉淀產生為止，透析后酶液經冷凍干燥制成酶粉，即為部分純化酶，使用時以純水稀釋。

1.2.2 指標測定

1) 過氧化物酶活性。參考AMAKO等[21]的方法測定。1個酶單位定義為測定條件下每1 min OD470變化0.1所需的酶量。酶的純化倍數采用下列公式計算：

S=U/C

M=CV

F=S1/S0

Y=M1/M0

式中，S指酶的比活力(U/mg)，S1指部分純化酶后的比活力，S0指粗酶比活力；U指酶的活性單位(U/mL)；C指酶蛋白的濃度(mg/mL)；M指酶蛋白的含量(mg)，M1指部分純化后總蛋白含量，M0指粗酶總蛋白含量；V指酶液體積(mL)；F指酶的純化倍數；Y指酶蛋白的回收率(%)。

2) 蛋白質含量。采用BRADFORD[22]染色法測定，以牛血清蛋白作標準蛋白。

1.2.3 不同因素處理NP的去除效果

1) 酶濃度。0.05 mol/L pH 7的磷酸-檸檬酸緩沖液中含有10 μmol/L NP(后續試驗均使用此濃度)，200 μmol/L H2O2，反應溫度25 ℃。試驗設置5個處理，即分別加入厚樸葉部分純化酶，使反應溶液中酶濃度為5 U/mL、10 U/mL、25 U/mL、40 U/mL及60 U/mL的，研究不同酶濃度對去除NP的影響。

2) 溫度。0.05 mol/L pH 7的磷酸-檸檬酸緩沖液中含60 U/mL過氧化物酶，10 μmol/L NP，200 μmol/L H2O2。試驗設置6個處理，即反應溫度分別為10℃、20℃、25℃、30℃、40℃及50℃，考察不同溫度對厚樸葉部分純化酶去除NP的影響。

3) pH。0.05 mol/L pH 7的磷酸-檸檬酸緩沖液中含60 U/mL過氧化物酶，10 μmol/L NP，200 μmol/L H2O2，反應溫度為25℃。試驗設置9個處理，考察不同pH對厚樸葉片部分純化酶去除NP的影響。其中，pH 3～5采用乙酸緩沖液，pH 6～8 采用磷酸鹽緩沖體系，pH 9采用硼酸鹽緩沖液，pH 10～11采用碳酸鹽緩沖液。

4) NP與H2O2的濃度比。0.05 mol/L pH 7的磷酸緩沖液中含10 μmol/L NP，60 U/mL過氧化物酶，溫度為25℃，分別按H2O2與NP摩爾濃度比為2∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、50∶1、80∶1和100∶1加入H2O2溶液，考察H2O2與NP不同摩爾濃度比對厚樸葉過氧化物酶部分純化酶去除NP的影響。

5) 有機質富里酸(Fulvic Acid，FA)和腐殖酸(Humic acid，HA)。在pH 7的磷酸緩沖液中含10 μmol/L NP，60 U/mL過氧化物酶，溫度25℃條件下，分別改變反應體系中FA和HA的質量濃度為0 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L，考察不同FA與HA濃度對厚樸葉片部分純化酶去除NP的影響。反應混合物置于恒溫水浴鍋中攪拌，加入200 μmol/L H2O2溶液啟動反應，反應體系共20 mL。于反應0 min(未加過氧化氫時)、1 min、3 min、5 min、15 min、45 min、90 min、120 min和180 min時分別取1 mL反應溶液，加入2 mL甲醇終止反應，即實現厚樸葉片過氧化物酶對的去除。在終止反應液里加入適量明礬，搖勻，過夜沉淀后8480 r/min離心10 min。上清液過0.22 μm濾膜后檢測NP濃度。

1.2.4 NP濃度檢測 1)色譜分析條件。NP濃度采用高效液相色譜-飛行時間質譜法[23]測定，采用Agilent 公司ZORBAX C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色譜柱。流動相為80%甲醇-水溶液，柱溫30℃，體積流量0.2 mL/min。2)質譜分析條件。ESI離子源負模式，干燥氣溫度350℃，流速10 L/min；霧化器壓力45psig，毛細管電壓3500V，錐孔電壓65V，采集速度1.5 spectra/s，選擇離子(ESI)采集方式，選定的分子離子[M-H]-的質荷比為219.18。

2 結果與分析

2.1 厚樸葉過氧化物酶的分離純化

研究發現，未經純化的粗酶液極不穩定，48 h后酶活基本消失，通過硫酸銨分級沉淀和雙水相萃取等對厚樸葉過氧化物酶進行部分純化、硫酸銨分級沉淀后酶液呈褐色，說明仍存在大量色素；經雙水相萃取后色素集中在上相，過氧化物酶主要集中濃縮在下相的硫酸銨溶液中，經4℃透析后酶液的酶活在48 h內保持穩定，冷凍干燥制成酶粉后低溫保存，酶活可以在數天內穩定不變。從表1可知，經雙水相萃取部分純化后過氧化物酶的酶活性從653.8 U升至3 125.1 U，純化倍數為8.4倍，酶活回收率為68.6%，純化效果良好。

表1 厚樸葉過氧化物酶的分離純化Table 1 Separation and purification of peroxidase extracted from M.officinalis leaves

2.2 不同因素處理NP的去除效果

2.2.1 過氧化物酶濃度 從圖1看出，隨反應體系酶濃度的升高，NP的剩余率呈逐漸下降趨勢，即去除率逐漸升高；隨反應時間延長，各濃度處理的去除速度呈先快后慢趨勢，去除速度依次為60 U/mL>40 U/mL>25 U/mL>10 U/mL>5 U/mL。當酶濃度達60 U/mL時，3 h后可以完全去除NP，低于該濃度則不能完全去除。

圖1 不同濃度厚樸葉過氧化物酶對NP的去除效果Fig.1 Scavenging NP efficiency of peroxidase with different concentrations

2.2.2 溫度 從圖2看出，溫度為10～50℃，3 h后反應體系中的NP均能夠被完全去除；在3 h內，溫度越高達到完全去除所需要的時間越短；溫度為50℃時，對NP去除率最高，達99.9%。表明，溫度對該酶催化去除NP的影響較小。

圖2 不同溫度處理厚樸葉過氧化物酶對NP的去除效果Fig.2 Scavenging NP efficiency of peroxidase at different temperature

2.2.3 pH 從圖3可知，在pH為3～7時，3 h后厚樸葉過氧化物酶對NP的最終去除率均能達99%，在此pH范圍內，pH越低去除反應越迅速。表明厚樸葉過氧化物酶在清除NP時具有較廣的pH范圍；但其在 1 min內達到的清除速率不一致，pH 11在1 min內幾乎不能夠清除NP，但在pH<6的條件下，清除率可達60%以上。

圖3 不同pH條件下厚樸葉過氧化物酶對NP的去除效果Fig.3 Scavenging NP efficiency of peroxidase under different pH condition

2.2.4 H2O2與NP的摩爾濃度比 從圖4看出，當H2O2與NP的摩爾濃度比為5～30時均能達到較好的去除效果，其清除率均在95%以上。H2O2與NP的摩爾濃度比<20時，3 h后NP的去除率和去除反應速率隨著摩爾濃度比的增大而升高；而摩爾濃度比>20時，3 h后NP的去除率和去除反應速率隨著摩爾濃度比的增大反而降低，其最終去除率在80%左右。表明，過高的H2O2濃度會抑制該酶的去除反應。

圖4 H2O2與NP不同摩爾濃度比處理厚樸葉過氧化物酶對NP的去除效果Fig.4 Scavenging NP efficiency of peroxidase under different H2O2 /NP concentration ratio

2.2.5 FA與HA 從圖5看出，隨著FA濃度升高，NP被去除速率呈下降趨勢，但經過3 h后去除率均達95%以上，表明，污水環境中主要有機污染物FA對厚樸過氧化物酶催化去除NP具有一定影響，但影響不明顯。隨著HA濃度的加大，催化去除NP的反應速率變慢，當HA濃度>2 mg/L時，經過3 h后，對NP的最終去除率達90%左右；而HA<2 mg/L時則不影響對NP的最終去除率。表明，厚樸過氧化物酶催化去除NP的反應可以耐受較高濃度HA的影響。總的趨勢是FA和HA均降低了酶催化去除的效率，HA對去除率的影響大于FA。

圖5 不同濃度FA和HA處理下厚樸葉過氧化物酶對NP的去除效果Fig.5 Scavenging NP efficiency of peroxidase under different FA and HA concentration

3 結論與討論

該研究從厚樸葉中分離、部分純化得到過氧化物酶，并利用其催化H2O2清除NP。不同植物來源POD的性質以及清除的對象不同導致清除反應的最佳條件不同。該研究結果表明，厚樸過氧化物酶在10～50℃可以保持催化清除NP的良好效果，在溫度為50℃時，對NP的清除率達99.9%，溫度對NP去除率影響較小。與洪健等[20]的研究結果相似。該研究表明，厚樸過氧化物酶清除NP的最佳pH為3～7，在pH 3～11范圍內，厚樸葉POD酶活性均保持在較高水平，清除率均達99%，表明厚樸過氧化物酶酸堿穩定性較好，不易失活。但在pH 3～11，pH越小，催化清除NP的反應越迅速，與夏青等的研究結果相似[24-25]，可能是由于溶液中的OH-逐漸增加會抑制H2O2分解過程中·OH的產生[26]，減慢了催化反應速率并影響最終降解率。趙廣華等[27]不同濃度的H2O2催化降解雙酚A實驗結果表明，催化反應體系中H2O2與雙酚A最適摩爾比為5，在50 min內可以完全清除。在本研究中，厚樸過氧化物酶反應體系中NP與H2O2最適摩爾比為1∶20，相較之下，利用厚樸過氧化物酶催化氧化NP需要更高的H2O2濃度，其酶促降解反應的作用趨勢表現為當NP與H2O2摩爾比低于最適摩爾比時，酶對NP的催化去除率隨NP與H2O2摩爾比增加而增加，當NP與H2O2摩爾比高于最適摩爾比時，酶對NP的催化去除率隨NP與H2O2摩爾比增加而降低。

研究結果表明，污水環境中主要有機污染物FA和HA對酶催化去除污染產生了重要影響。向厚樸過氧化物酶清除NP反應體系中添加FA和HA，均可抑制酶促去除NP的效率，但HA的抑制作用比FA更明顯。FA濃度為0～50 mg/L時，清除率仍能夠達到95%以上。HA濃度為10～50 mg/L時，清除率降至90%左右。其對過氧化物酶清除NP反應的抑制作用推測是由于HA結構中可能含有大量的羰基、羧基等具有自由基的活性官能團，能對催化去除NP反應產生影響。因此在工業中應用時應注意在上游對HA的凈化處理。

經過硫酸銨分級沉淀、雙水相萃取從厚樸葉片中分離得到一種活性較高、性質穩定的過氧化物酶，該酶的純化倍數為8.4倍，比活力可達25 663.1 U/mg蛋白，仍有待進一步純化。在厚樸過氧化物酶濃度為60 U/mL，pH 3～11，溫度10～50℃，H2O2與NP物質的量濃度之比為5～30條件下，該酶對NP的催化去除率達 95% 以上，最高可達99.9%的去除率，且反應后溶液中酶活即3 h后剩余酶活并未出現明顯的下降趨勢，仍有利用空間。向厚樸過氧化物酶催化去除NP反應體系中添加FA和HA，均可輕微抑制酶促去除NP的效率，其中又以HA的抑制作用比FA更明顯。顯示厚樸過氧化物酶具有較寬的pH和溫度適應范圍以及較高的去除率和抗有機污染能力，在酚類污染治理方面具有巨大潛力。