金線蓮的組培快繁體系優(yōu)化及其有效成分的含量

王雨婷，雷彩霞，程國威，夏 芮，李金枝,3*

(1.麗水學院 生態(tài)學院，浙江 麗水 323000；2.葛洲壩水務(臺州)有限公司，浙江 臺州 317500；3.臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000)

金線蓮是我國傳統(tǒng)珍稀名貴中草藥，含有生物堿等大量活性成分，具有消炎、降壓、抗腫瘤、抗衰老、保肝等功效[1]。金線蓮種子細小、發(fā)育不完全，在自然條件下的萌發(fā)率和繁殖率低[2]，且其對生態(tài)環(huán)境條件要求嚴格，而近年來人為的過度采挖更導致了野生資源處于瀕臨滅絕之地[3]，急需進行人工栽培。長期以來，人們用分株的方法很難實現(xiàn)大量繁殖，只有利用組織培養(yǎng)才能進行快速大量繁殖[4]。多數(shù)研究認為金線蓮莖段是最佳的快繁外植體[5-6]，也有認為莖片最佳的研究[7]。在金線蓮誘導培養(yǎng)方面，對于不同激素的使用及用量方面存在較大差異[8-18]。為此，為進一步優(yōu)化金線蓮組培快繁體系，并提高其有效成分的含量，對金線蓮的組織快繁體系進行優(yōu)化，旨在為金線蓮的大量繁殖和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017年6-10月在麗水學院生態(tài)實驗樓進行。金線蓮是蘭科開唇蘭屬花葉開唇蘭(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.)，來自福建省漳州市南靖縣的福建金線蓮美人紅，購自網(wǎng)店“福建金線蓮苗廠家直銷”。選擇健壯、無病蟲害、根系發(fā)達、莖粗壯、株高6～11 cm的金線蓮幼苗作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設置不同濃度的激素組合，每個培養(yǎng)基都加入蔗糖3%和瓊脂0.7%，pH調(diào)至5.8，121℃滅菌20 min。參照前人對金線蓮組織培養(yǎng)在不同階段的培養(yǎng)基優(yōu)化方案，對不同階段的培養(yǎng)基設置系列優(yōu)化配方(表1)。

1) 誘導培養(yǎng)。在無菌條件下，將處理好的外植體(莖段和莖片)接入已滅菌的誘導培養(yǎng)基中，每組接6瓶，每瓶接2個。接種后，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度(25±2)℃，濕度50%～60%，光照強度約1 000 lx，光周期為16 h/8 h。通過對比不定芽的誘導情況篩選出最佳外植體和最佳誘導培養(yǎng)基。以MS+NAA 0.3 mg/L+ZT 0.15 mg/L為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L和4.0 mg/L。

表1 金線蓮的組織培養(yǎng)在不同階段的培養(yǎng)基優(yōu)化試驗方案Table 1 Optimization scheme of media at different culture stages in A.roxburghii tissue culture

2) 增殖培養(yǎng)。經(jīng)過誘導培養(yǎng)后，按照不定芽的大小粗壯程度分為3組，將長勢一致的不定芽分別接入不同濃度的增殖培養(yǎng)基中，以保證每組增殖培養(yǎng)基中接入的不定芽長勢一致，進而篩選出最佳增殖培養(yǎng)基。以MS+6-BA 2.0 mg/L為基本培養(yǎng)基，分別添加NAA 0.2 mg/L、0.4 mg/L和0.6 mg/L。

3) 生根培養(yǎng)。經(jīng)過增殖培養(yǎng)后，把叢生苗按長勢挑選分組，將長勢一致的叢生苗分別接入不同濃度的生根培養(yǎng)基中，以保證每組生根培養(yǎng)基中接入的叢生苗一致，進而篩選出最佳生根培養(yǎng)基。以1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭1.0 g/L+香蕉泥50 g/L為基本培養(yǎng)基，分別添加NAA 0.1 mg/L、0.3 mg/L和0.5 mg/L。

4) 總黃酮含量的測定。稱取干燥至恒重的蘆丁標準品100 mg，加75%的乙醇溶解定容至250 mL，分別吸取0 mL(CK)、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL于25 mL容量瓶中，補加蒸餾水至2.4 mL，用NaNO2-Al(NO3)3作顯色劑進行標準曲線的繪制和總黃酮的測定[19]，以金線蓮組培苗不添加蘆丁乙醇溶液為對照。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以平均數(shù)±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 誘導培養(yǎng)

試驗中接種的金線蓮莖片全部玻璃化，誘導率為0。以莖段為研究對象，從各組不定芽長勢最優(yōu)的外植體生長情況(圖1)看出，C組和D組不定芽長勢較好。莖段接種于誘導培養(yǎng)基50 d后，A、B、C和D組的誘導率分別為25%、17%、60%和25%，平均誘導率為31.75%，C組誘導率最高。綜上所述，金線蓮組培快繁的最佳外植體為莖段。C組所用培養(yǎng)基為最佳誘導培養(yǎng)基(MS+NAA 0.3 mg/L+ZT 0.15 mg/L+6-BA 3.0 mg/L)。

圖1 金線蓮莖段誘導培養(yǎng)的不定芽生長情況Fig.1 Growth situation of adventitious buds of A.roxburghii stem segments on induction medium

2.2 增殖培養(yǎng)

將長勢一致的不定芽分別接入不同濃度的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，從每組側(cè)芽增殖的不定芽生長情況(圖2)看出，G組側(cè)芽增殖數(shù)明顯多于E組和F組。增殖培養(yǎng)55 d 后，E、F和G組的增殖倍數(shù)分別為2.20倍、1.00倍和4.75倍，G組的增殖倍數(shù)明顯高于E組，E組又明顯高于F組，且三者間的差異達顯著水平。由此可見，G組所用培養(yǎng)基是最佳增殖培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L)。

圖2 金線蓮的不定芽增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生苗Fig.2 Clustering plantlets produced by A.roxburghii adventitious buds on proliferation medium

2.3 生根培養(yǎng)

從圖3看出，叢生苗接入生根培養(yǎng)基25 d后，X組叢生苗平均有2～3條根，Y組2～6條，Z組3～5條。新根生根率從高到低依次為Z組、Y組和X組，分別為134%、100%和25%。Y組和Z組的生根效果都較好，但差異不顯著，在效果差異不大的情況下優(yōu)先采用濃度較低的處理，即Y組?？梢?，Y組所用培養(yǎng)基(1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭1.0 g/L+香蕉泥50 g/L+NAA 0.3 mg/L)是最佳生根培養(yǎng)基。

圖3 金線蓮叢生苗的生根培養(yǎng)情況Fig.3 Rooting culture situation of A.roxburghii clustering plantlets

2.4 總黃酮含量

有文獻報道野生金線蓮總黃酮含量在0.64%～0.82%[20]，首先測得總黃酮含量測定的標準曲線為y=11.16x-0.002 7(R2=0.997 8)，然后依據(jù)標準曲線公式計算得到組培苗中總黃酮含量。試驗獲得的組培苗總黃酮含量高低依次為Y組、X組、Z組和對照，分別為1.04%、1.02%、0.92%和0.81%。金線蓮組培苗的總黃酮含量在0.92%～1.04%，與對照差異不大，但明顯高于野生金線蓮，其中Y組培養(yǎng)的組培苗略優(yōu)于X組和Z組。由此可見，Y組更有利于金線蓮中總黃酮含量的積累。

3 結論與討論

雖然前人已對金線蓮組織培養(yǎng)有過相關試驗，但是對于激素的種類及用量并沒有形成統(tǒng)一，因此在比較前人的試驗設計[8-18]后設置的本試驗方案，研究表明，在誘導培養(yǎng)階段添加ZT對誘導愈傷組織或不定芽具有明顯的效果，因此，把ZT作為試驗基本培養(yǎng)基的成分。6-BA作為一種細胞分裂素在愈傷組織和不定芽的形成過程中具有重要作用，因此6-BA的濃度配比至關重要，試驗以一系列6-BA的濃度梯度作為變量。而且，前人研究表明增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段采用的激素種類差異不大，但激素濃度存在一定差異，因此，試驗選擇其中一種濃度配比上存在較大分歧的激素NAA作為變量進行試驗，以期得到較優(yōu)的激素配比。

采用金線蓮的莖片和莖段作外植體，試驗結果表明莖片誘導率為0，不適宜作為金線蓮組培外植體，這可能是由于品種不同所造成[7]。莖段的誘導率為31.75%，相對較優(yōu)，由此可見金線蓮的組培快繁最佳外植體是莖段。

對金線蓮誘導、增殖和生根不同生長時期采用不同濃度配比的培養(yǎng)基配方進行培養(yǎng)，得到金線蓮的最佳誘導培養(yǎng)基為MS+NAA 0.3 mg/L+ZT 0.15 mg/L+6-BA 3.0 mg/L，誘導率達60%；前人在使用莖段作為外植體誘導不定芽時，誘導率有較大差異：誘導率有25%～50%的，也有大于100%的[8-10]，相比較之下試驗設置的激素配比存在一定的可取性。最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L，增殖倍數(shù)為4.75，優(yōu)于前人研究結果(增殖倍數(shù)多在2.5～4.5[7-13])，因此認為，試驗得到的最佳增殖培養(yǎng)基具有一定的參考價值。最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ IBA 1.0 mg/L+活性炭1.0 g/L+香蕉泥50 g/L+ NAA 0.3 mg/L，生根率達134%；而前人研究的叢生苗生根率在30%～97%[14-18]，試驗得到的最佳生根培養(yǎng)基明顯優(yōu)于前人的，也具有重要參考價值。

金線蓮既具有觀賞價值又具有藥用價值?？傸S酮是金線蓮的主要有效成分之一，其含量直接影響金線蓮的功效。經(jīng)過組培后的金線蓮總黃酮含量在0.92%～1.04%，明顯高于野生金線蓮，由此可見，試驗設置的培養(yǎng)基配方有利于金線蓮總黃酮的積累。試驗結果為金線蓮的大量繁殖和進一步開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。