HKU1型冠狀病毒纖突蛋白受體結合域研究進展

陶靖隆，王玉梁，關超玲，王俊虹，趙國平 綜述 魏茂提 審校

人冠狀病毒(human coronavirus，HCoV)是引起人類感染的一類重要病毒。該類病毒危害最為嚴重當屬2002—2003年的嚴重呼吸道綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)[1]，SARS-CoV的傳播和流行造成世界范圍內8422人感染，病死率為11%[2](不同國家或地區病死率為7%～24%)。SARS-CoV的傳播和流行，顛覆了冠狀病毒只引起人類輕微呼吸道感染癥狀的傳統觀點。自2012年9月起，一種感染特征與SARS相似的新冠狀病毒——中東呼吸道冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV，該病毒最初被稱為EMC)再次發生流行[3]。據WHO資料，截至2016年12月23日，全世界范圍內發生1864例感染該種冠狀病毒，病死659例，病死率為35.35%(95% CI 33.18%-37.52%)[4]。我國部分地區在2005-2009和2009-2011年間的臨床流感樣病例監測資料顯示，冠狀病毒檢出率分別是1%和16%[5,6]，本課題組2009-2011年監測結果也顯示冠狀病毒檢出率在1.86%。雖然我國目前并未監測到大規模的冠狀病毒流行或暴發，但是冠狀病毒在我國流行的風險仍然存在。HKU1型冠狀病毒(HKU1-coronavirus，HKU1-CoV)自2005年發現至今由于在國內感染率較低，臨床癥狀較輕，分離鑒定難度高，研究進展緩慢。作為唯一一種沒有確定人體細胞受體的冠狀病毒，隨著MERS-CoV流行也引起了研究者的關注，筆者主要從病毒的Spike蛋白及可能的人受體方面進行綜述。

1 HKU1-CoV流行病學及其危害

HKU1-CoV是2005年Woo等[7]從一個由深圳返回香港的71歲肺炎患者鼻炎抽吸物中發現的，因香港大學率先發現故命名為HKU1型。時間分布上，HKU1-CoV感染無明顯季節性特征，呈四季散發狀態。資料顯示，不同地區HKU1-CoV檢出率有所差異[8-12]。如日本報道HKU1-CoV陽性率為1.9%，美國HKU1-CoV陽性率為0.5%，韓國HKU1-CoV陽性率為2.5%，馬來西亞HKU1-CoV陽性率為1.1%，肯尼亞為2.1%。我國不同時期該冠狀病毒流行狀況不一。2005-10至2006-01我國湖南資料的檢出率約為0.77%[13]，但2008-2010年北京地區檢出率約為17.9%[14]。可見，HKU1型冠狀病毒在我國的流行風險較高，需要研究進一步關注。

兒童普遍易感，多與其他病原存在共同感染。研究發現HKU1-CoV與上呼吸道感染及社區獲得性肺炎相關，對兒童影響較大，其他人群易感性無明顯差異[15]。同時，該病原可能造成兒童人群更加嚴重的臨床癥狀。Lau等[16]研究了625例6個月至5歲的呼吸道病毒感染住院患兒熱性癲癇發作情況, 發現HKU1-CoV感染患兒熱性癲癇發生率為50%, 明顯高于NL63型冠狀病毒、229E型冠狀病毒、OC43型冠狀病毒、流感病毒A、B，腺病毒等12種呼吸道病毒﹙為0 ～ 33%﹚。雖然HKU1-CoV是通過呼吸道標本發現，但是該病原也可引起消化道癥狀。如，法國學者Vabret等[17]發現, 6 例HKU1-COV陽性患者中, 3例出現發熱、嘔吐、腹瀉及上呼吸道癥狀, 且以胃腸道不適為主訴入院, 并在其中2例患者的糞便發現該病毒。

2 HKU1-CoV 纖突蛋白

HKU1-CoV基因組全長29926bp(genBank: AGW27872.1)，為無節段單股正鏈RNA。HKU1-CoV纖突蛋白(spike protein，S protein)由1356個氨基酸殘基組成，是一種典型的I型病毒膜融合蛋白，具有抗原性，位于病毒表面，能介導病毒與宿主受體的結合，在病毒黏附和進入宿主細胞過程中起到重要作用，是影響冠狀病毒侵襲力最重要因素之一[18,19]。有研究表明冠狀病毒跨物種傳播也是通過S蛋白變異實現的[20]。已發表的冠狀病毒S蛋白一級結構特點相吻合，即從N端到C端可分為S1段、斷裂區段、S2段、跨膜區段、包內區段等部分[21]。S蛋白三級結構呈“柄-球”樣結構，S1段主要構成S蛋白的球形部分，S2段主要構成S蛋白柄狀結構部分。HKU1 S蛋白自N端至C端可分為S1段(14-757aa)、斷裂區段(758-900aa)、S2段(901-1356aa)。HKU1-CoV S1亞結構有兩個獨立結構域，分別是N端結構域(N-terminal domain，S1-NTD，14-297aa)和C端結構域(C-terminal domain，S1-CTD，325-605aa)[22]。雖然HKU1 S蛋白結構與其他冠狀病毒相似，但是HKU1 S蛋白是否具有與其他冠狀病毒S蛋白相似的作用尚需進一步研究。S2上存在的HR1(heptad repeat 1，HR1)、HR2(heptad repeat 2，HR2)，這個區域的特點會在病毒入侵宿主細胞中起到重要作用。

冠狀病毒S1是冠狀病毒與宿主細胞受體作用的關鍵部位，也是冠狀病毒S蛋白研究的重點之一。目前研究發現冠狀病毒S蛋白與宿主作用的區域大致可以分為兩個區域：核心(Core)和延伸環(Extend Loop)兩個亞結構域。核心區較為保守，由反向平行的β片層和短的鏈接α螺旋組成，起到支撐延伸環區結構的作用。延伸環處于核心區外圍，由Loop結構為邊和β片層為底的凹型結構，具有較好的柔性；延伸環區域含有病毒與宿主受體結合的受體結合域(receptor-binding domain，RBD)，能夠單獨或共同作與宿主受體結合。RBD內含有與宿主受體特異性識別的Motif(receptor-binding motif，RBM)，是病毒與宿主細胞受體作用的關鍵部位[21]。目前研究發現HKU1-CoV S1結構特點與其他冠狀病毒S蛋白研究結果一致。Kirchdoerfer等[22]利用電鏡三維重構方法獲得了HKU1-CoV纖突蛋白晶體結構，本課題組也使用同源建模方法獲得了HKU1-CoV S1-NTD、CTD模型，與文獻報道結構比對RMSD均小于2 ?。蛋白三級結構顯示HKU1-CoV S1-NTD和S1-CTD含有核心和延伸環兩個亞結構域，見圖1。HKU1-CoV S1-NTD核心區由6組兩兩反向平行的β片層構成，空間結構顯示上3對與下3對平行；Loop區較長且較雜亂，主要有單個的α螺旋和β片層及非特殊構象殘基連接而成，包繞在核心區外圍，見圖1(A)；HKU1-CoV S1-CTD核心區由2對兩兩反向平行的β片層構成基本結構；Loop區由一對反向的β片層和4個獨立的α螺旋連接而成，位于核心區上部，見圖1(B)。雖然HKU1-CoV S蛋白在病毒入侵中的作用機制并不是清楚，但是這些研究為進一步探索HKU1-CoV入侵宿主細胞提供了很好的參考和指導。

3 HKU1-CoV S蛋白與受體相互作用

3.1 S蛋白受體分類 冠狀病毒的S1通過RBD與宿主細胞受體識別并結合，導致S2由融合前結構變構為融合后結構，變構后的S2區域拉近了病毒膜與細胞膜空間距離，進而促使病毒膜和宿主膜融合。在病毒膜與細胞膜融合過程中，冠狀病毒與宿主細胞受體特異性識別是所有后續反應的先決步驟，是病毒入侵宿主細胞的關鍵，決定了病毒的組織嗜性和侵襲力[23]。

圖1 HKU1-CoV S1結構

冠狀病毒常見受體可分為蛋白類受體和非蛋白類受體，蛋白類受體目前已知的有APN、DPP4、ACE2三種；非蛋白類受體已知唾液酸類和CEACAM1。冠狀病毒與非蛋白類受體往往是非特異性結合，而與蛋白類受體往往是特異性結合。冠狀病毒的受體選擇與冠狀病毒S蛋白結構和冠狀病毒傳播過程中發生的進化、變異有關[21]。冠狀病毒與非蛋白類受體的非特異性結合可以保證具有廣泛的宿主范圍，而蛋白類受體的特異性結合可以使得冠狀病毒具有特定的宿主。不同類冠狀病毒具有不同的受體喜好。目前研究認為，α冠狀病毒通常多可與非蛋白類受體相互作用，β冠狀病毒通常與蛋白類受體相互作用(圖2)。

3.2 S蛋白與受體相互作用 S蛋白與受體相互作用的過程中由于不同部位的S蛋白作用不同，其作用大致分為3個途徑：(1)S蛋白的S1-NTD與非蛋白類分子結合。例如MHV通過S1-NTD與CEACAM1相互作用起到識別宿主作用。(2)S1-CTD與蛋白類分子結合，例如SARS-CoV、NL63-CoV通過S1-CTD上的RBM與ACE2作用起到識別宿主作用； MERS-CoV通過S1-CTD與DPP4(CD26)特異性識別特異性入侵宿主；(3)S1-NTD、S1-CTD協同作用與細胞受體結合而實現，例如TGEV入侵宿主細胞時， S1-NTD可與唾液酸結合，CTD可與APN相互作用[18,19,23,25,26,27]。與非蛋白類小分子作用的變體通常暴露于宿主細胞表面，便于病毒獲取并與之相互作用。病毒與蛋白類受體相互作用發生頻率較低，要求條件較為苛刻，但較病毒-非蛋白類受體具有良好的穩定性和特異性。Li等[21]認為，冠狀病毒與宿主細胞受體作用時，先通過S1-NTD與非蛋白類受體相互作用拉近病毒-細胞距離，進而通過S1-CTD與蛋白類受體穩定的相互，但這種說法的普遍適用性還有待進一步驗證。

圖2 冠狀病毒S蛋白與細胞表面受體關系[27]

HKU1-CoV S1-NTD與Bovine冠狀病毒S1-NTD一級結構具有較高相似性，具備與糖類非蛋白受體相互作用的結構基礎，故可能與糖類分子相互作用，進行非特異性病毒-受體結合[22]。然而，有研究者認為[28]，雖然唾液酸參與了HKU1-CoV與宿主細胞受體結合的過程，但是不同于OC43型冠狀病毒，HKU1-CoV不能與9-O-Acetylated Sialic Acid相互作用。進一步實驗結果表明，去除S1-NTD后，HKU1-CoV仍可以感染宿主細胞[29]。為此，推測HKU1-CoV可能將唾液酸作為受體入侵宿主細胞。作為生物小分子的唾液酸可能就起到媒介作用介導病毒與宿主細胞受體作用，即病毒與宿主細胞受體作用通過近似于“酶作用模型”的原理進行。然而，HKU1-CoV與非蛋白類受體可能具有獨特的入侵途徑。

除了S1-NTD與非蛋白類受體的非特異性結合外，HKU1-CoV S1-CTD與SARS-CoV、MERS-CoV蛋白一級序列上具有一定的相似性。然而，三級結構顯示HKU1-CoV S1-CTD與β冠狀病毒中的SARS-CoV、MERS-CoV S1-CTD在具有一定程度上的相似性，主鏈間RMSD分別為3.19?和2.53?。與SARS、MERS S1-CTD只有Loop存在活性位點不同，HKU1-CoV S1-CTD含有兩個可能與其他蛋白作用的活性結構域，一個結構域存在于Loop區域，被認為是與體細胞受體相互作用的RBD；另一個是位于核心區域下方的一段有兩個α螺旋構成的結合域，可與相鄰HKU1-CoV S1-CTD的Loop結合[18,22,26,27]。然而，HKU1-CoV S蛋白容易形成三聚體，而這種結構特性往往會影響了該病毒S蛋白與宿主受體的相互作用[22]。本課題組通過對HKU1-CoV S1-CTD結構活性位點預測分析發現，該結構位于Loop的活性位點位于Loop的側面位置，而此區域在HKU1-CoV S蛋白三聚體結構中并未暴露于表面位置。但是，當病毒S蛋白變構，變構形成的融合結構就可與細胞受體特異性識別并結合。可見，空間結構的不容易暴露可能影響了HKU1-CoV S蛋白受體的發現。然而，不管HKU1-CoV S蛋白結構如何，該病毒的S1-CTD是其入侵宿主細胞的關鍵亞結構域[29]，其詳細的入侵機理尚需進一步探索。

總之，HKU1-CoV與宿主細胞受體作用機制可能具有一定的獨特性，也不同于過去已經明確的冠狀病毒-受體作用機制。鑒于HKU1-CoV病原意義的重要性，探索病毒入侵、跨物種傳播的機制將為疾病防控、疫苗開發等工作提供依據。