碳氮比對干黃秸稈貯存及后續甲烷產量的影響

崔 憲，張樂平，孫 輝，溫嘯宇,2，郭建斌，董仁杰,3

碳氮比對干黃秸稈貯存及后續甲烷產量的影響

崔 憲1，張樂平1，孫 輝1，溫嘯宇1,2，郭建斌1※，董仁杰1,3

（1. 中國農業大學工學院，北京 100083；2. 中共中央黨校研究生院，北京 100091；3. 中國農業大學煙臺研究院，煙臺 264670）

秸稈的有效貯存，是保證秸稈沼氣工程全年穩定運行的前提。干黃秸稈因其處于可溶性碳源與氮源雙重缺乏狀態，成為影響貯存過程正常進行的重要原因。該文以干黃玉米秸稈為原料，通過補充可溶性碳源（蔗糖）與蛋白氮源（豆粕）調節秸稈初始C/N比后，分析其對秸稈濕貯存過程及后續甲烷產量的影響。當原料初始C/N比分別為30:1、25:1和20:1時。經60 d濕貯存試驗結果表明，與僅添加蔗糖處理組相比，對貯存過程的pH值和干物質損失無顯著影響（0.05），但有效降低了半纖維素含量，乳酸產量分別提高了19.0%、22.2% 和31.7%；通過分析貯存前后的細菌群落多樣性，結果表明，可提高秸稈濕貯存過程中有益菌（乳酸菌）的相對豐度，腐敗菌（梭菌屬）的相對豐度降至0；對濕貯存前后原料進行產甲烷潛力測試，結果表明，與貯存前相比，累積甲烷產量分別提高3.9%、6.1%和10.8%。綜上所述，通過補充可溶性碳源與蛋白氮源調節干黃秸稈C/N比，可改善干黃秸稈濕貯存過程的品質、穩定性和生物可降解性，并有效提高后續甲烷產量。研究結果可為秸稈沼氣工程的貯存環節提供技術支撐。

秸稈；發酵；甲烷；干黃玉米秸稈；濕貯存；厭氧發酵；C/N比；乳酸

0 引 言

玉米秸稈作為一種可再生生物質資源，是中國主要農業廢棄物之一。據統計，2017年其產量達2.7億t[1]?！敖?沼-肥”能源生態模式是中國北方糧食主產區秸稈綜合利用的主要推廣模式之一。其以厭氧發酵技術為核心，同步實現秸稈能源化與肥料化綜合利用，促進農業可持續發展。因玉米秸稈生產具有季節性，為了保證規?；託夤こ倘攴€定運行，適宜的貯存方法是必要的[2]。與干貯存相比，濕貯存具有干物質損失低、原料均一性好、火災風險低以及生物可降解性高等優勢，在歐洲被廣泛應用于秸稈沼氣工程中[3-5]。

在中國，由于秸稈原料收集渠道和輸送方式不一，導致用于沼氣工程的秸稈以干黃玉米秸稈居多[6]，與國外沼氣工程利用的青綠玉米秸稈相比，理化性質差異較大，處于可溶性碳源缺乏狀態，不利于濕貯存進行[7]。前期研究成果表明通過補充添加劑（葡萄糖、纖維素酶）或者混合貯存等方式可以改善干黃玉米秸稈可溶性碳源缺乏狀態[1,6]，提高濕貯存品質。同時，秸稈原料碳氮比一般為100～60:1[8-10]，不僅處于氮源缺乏狀態，影響貯存過程中微生物活性，而且遠高于厭氧發酵對于原料碳氮比要求的30～20:1[11]，不利于厭氧發酵的進行。國內外研究主要是通過非蛋白氮（尿素、氯化銨等）改善干黃玉米秸稈氮源缺乏狀態[12-14]，調節秸稈碳氮比。然而，與非蛋白氮相比，蛋白氮源物質（豆粕、酒糟等）不僅可以調節碳氮比，也可以在后續厭氧發酵過程中轉化為能源物質，而且有研究表明蛋白氮對乳酸菌有增殖作用，可以提高乳酸產量[15-16]，有利于降低貯存干物質損失。目前，通過蛋白氮源調節干黃玉米秸稈濕貯存過程，進而對后續甲烷產量的影響研究較少。

因此，本文以干黃玉米秸稈為原料，通過添加可溶性碳源（蔗糖）與蛋白氮源（豆粕）協同調控貯存過程，分析不同碳氮比對原料貯存品質、細菌多樣性以及后續產甲烷潛力的影響，為秸稈沼氣工程原料的高效貯存提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

干黃玉米秸稈為2017年10月取自河南省鞏義市，品種為豐玉2號，為鮮食玉米品種。收獲后玉米秸稈含水率較高，呈青色，在自然條件下風干30 d左右后呈干黃色，風干后粉碎至1～3 cm的長度并運送至實驗室進行后續試驗。

豆粕取自九三集團天津大豆科技有限公司，為2016年7月生產的未膨化轉基因大豆粕。

原料產氣潛力測試的接種污泥取自北京城市污水處理廠，過10目篩除去沙粒，置于37 ℃的恒溫水浴鍋中，保持污泥活性。原料及污泥的理化性質見表1。

表1 干黃玉米秸稈、豆粕與接種污泥的化學組成

注：除總固體與揮發性固體以外，其他性質的單位均基于總固體計。

Note: Chemical composition are based on the total solid expect for total solid and volatile solid.

1.2 濕貯存原料調制與試驗設計

用FW80小型粉碎機（北京中興偉業公司，中國）將豆粕粉碎，與干黃玉米秸稈充分均勻混合。將蔗糖溶于一定量水中，均勻噴灑至混合好的秸稈與豆粕混合料（含水率為65%）。將調制好的各組原料分裝至聚乙烯袋中（尺寸：250 mm×300 mm），用真空包裝機抽真空并熱封處理后，放置于人工氣候箱（溫度28 ℃，無光照，相對濕度65%）濕貯存60 d，分別選取第0、7、15、30、60 d時的樣品分析pH值，發酵產物。選取貯存前后樣品分析干物質損失、可溶性碳水化合物含量、纖維素、半纖維素和木質素含量。各處理組的秸稈、水分、蔗糖和豆粕添加量如表2所示。

表2 濕貯存試驗設計

1.3 細菌多樣性及差異性研究

在無菌環境下，準備干黃玉米秸稈原料與濕貯存后的5個處理組各10 g與90 mL無菌生理鹽水混合，在37 ℃恒溫振蕩2 h得到微生物菌懸液，用孔徑0.22m無菌濾膜過濾得到微生物菌體。用滅菌手術剪剪碎，將整張帶有菌體的濾膜置于2 mL無菌離心管中，使用E.Z.N.A土壤DNA提取試劑盒進行微生物DNA提取，檢測合格后送至上海美吉生物科技有限公司進行Illumina Miseq測序。

PCR擴增區域為16S rDNA V4-V5，所用引物為338F (5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R (5- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)。根據Illumina MiSeq測序平臺的標準流程進行雙端（2×300 BP）測序，得到2×300 BP的數據。數據預處理后進行生物信息學分析、多樣性分析、物種組成分析和差異性分析。

1.4 厭氧消化試驗設計

厭氧消化試驗分別選取5個處理組濕貯存前后的樣品，共計10組進行試驗。設計只接種污泥處理組作為空白，用于計算污泥產氣量和秸稈甲烷凈產量。

該批次厭氧發酵試驗于帶有一次性鋁蓋的120 mL玻璃發酵瓶中進行。污泥與玉米秸稈的添加量基于揮發性固體質量之比為2:1添加，將污泥與秸稈加入發酵瓶中，充分混勻后，充入氮氣，隨后立即蓋好硅膠塞，標號后置于37 ℃恒溫水浴鍋中。試驗期間使用玻璃注射器測量日均產氣量，并分析計算累積產氣量。產氣潛能用修正的Gompertz模型（1）式進行擬合[17]。

=0×exp{?exp [max×e×0-1×(?)]+1}（1）

式中為扣除空白的時刻的累積氣體產量，mL/g（以揮發性固體（volatile solid, VS）計）；0為最大產能潛能，mL/g（以VS計）；max為最大產甲烷速率，mL/(g·d)（以VS計）；為遲滯期，d；為試驗持續的時間，d。

1.5 分析方法

總固體含量（total solid, TS）測定采用105 ℃干燥恒質量法，揮發性固體（volatile solid, VS）含量采用550 ℃灼燒恒重法。原料濕貯存后會產生大量有機酸，在105 ℃條件下進行總固體測定時有機酸揮發會引起測定結果偏低。因此，本文根據Kreuger等[18]報道的濕貯存原料在100 ℃下干燥時不同有機酸的揮發系數進行修正?？偺寂c總氮使用Vario EL cube型元素分析儀（Elementar元素分析儀，德國）測出。pH值使用Orin 5-Star 型pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）測定。半纖維素、纖維素和木質素的含量采用Van Soest Fiber方法，使用ANKOM A200型纖維分析儀（USA）進行測定。甲烷含量由SP-2100型氣相色譜儀（北瑞利分析儀器有限公司，中國）測定。揮發性脂肪酸與乙醇含量采用日本島津公司生產的GC-2010 Plus型氣相色譜儀測定。乳酸含量采用美國戴安公司生產的Dionex Ultimate U3000型高效液相色譜儀測定。揮發性脂肪酸、乳酸和乙醇的測定方法詳見文獻[19]。

1.6 數據處理方法

數據用Origin 8.5軟件整理制圖并進行修正的Gompertz方程擬合累積產氣曲線。利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，<0.05代表數據存在顯著性差異，>0.05代表數據不存在顯著性差異。采用LEfSe法分析物種差異性，其中Kruskal-Wallis檢驗與Wilcoxon檢驗的Alpha值為0.05。

2 結果與討論

2.1 濕貯存過程中各組的pH值及發酵產物分析

濕貯存過程中各組的pH值與發酵產物的變化結果見圖1。在濕貯存7 d內，5個處理組的pH值迅速下降。在貯存60 d時，CK組、S組、S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組的pH值分別達到6.1、4.2、4.3、4.2和4.3。與CK組相比，其余4組的pH值均顯著降低（0.05）。與S組相比，S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組對貯存pH值無顯著影響（0.05。乳酸質量分數分別達到7、63、75、77和83 g/kg（以TS計）。與S組相比，S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組分別提高了19.0%、22.2%和31.7%。乙酸質量分數分別達到5、10、12、13和13 g/kg（以TS計）。與S組相比，S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組分別提高了20%、30%和30%。所有組的丙酸質量分數均低于2 g/kg（以TS計）。丁酸質量分數分別達到22、2、0.9、0.7和0.7 g/kg（以TS計）。與S組相比，S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組分別降低了55%、65%和65%；乙醇質量分數分別達到2、4、5、5和5 g/kg（以TS計）。

注：測試指標的單位均基于總固體計。

pH值是衡量貯存品質優劣的最直接指標之一，pH值為4.1～4.3，質量良好；pH值為4.4～5.0，質量一般；pH值在5.0以上，質量劣[19]。有機酸總量及組成是表征貯存過程好壞的重要指標[7]，通常認為乳酸含量高，可以有效降低pH值抑制腐敗菌生長。乙酸可以提高開封后有氧穩定性，避免開封后原料腐爛[20]。丁酸含量越少越好，因其生成會造成大量干物質損失，導致能量損失[19]。CK組在貯存期間，pH值過高，乳酸含量低，丁酸含量高，貯存品質較差。據徐春城[19]報道，貯存初期，梭菌也有繁殖，但主要是在貯存后期，尤其是可溶性碳水化合物少的原料中，能發酵糖或有機酸的梭菌在貯存后期，將發酵乳酸產生丁酸，導致pH值升高。這與崔憲等研究結果一致[21]。與CK組相比，S組由于添加蔗糖作為發酵促進劑提高了乳酸、乙酸含量，降低了pH值與丁酸含量，這與Guo等研究結果一致[6]。與S組相比，通過添加蛋白氮源調節秸稈的C/N比，進一步提高了乳酸、乙酸含量，降低了丁酸含量。張亞麗等研究表明豆粕蛋白對乳酸菌有明顯的增殖作用[15]。

2.2 濕貯存前后各組的干物質損失及組成分析

濕貯存60 d后各處理組的干物質損失，由表3可知。CK組、S組、S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組的干物質損失分別為10.68%、5.05%、5.20%、5.50%和5.33%。與CK組相比，其余4組顯著降低了貯存過程中的干物質損失（<0.05）。與S組相比，S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組對干物質損失無顯著影響（>0.05）。

濕貯存前后可溶性碳水化合物、纖維素、半纖維素和木質素含量的變化，由表3可知。各處理組濕貯存60 d后，可溶性碳水化合物幾乎消耗殆盡。與濕貯存前相比，各處理組的纖維素含量與半纖維素含量均顯著降低（<0.05），木質素含量無顯著變化（>0.05）。濕貯存60 d后，與CK組相比，S組的纖維素和半纖維素含量無顯著變化（>0.05）；與S組相比，S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組纖維素含量無顯著變化（>0.05）；S-SM2組與S-SM3組的半纖維素含量顯著降低（<0.05）。

表3 濕貯存前后各組干物質損失、可溶性碳水化合物和木質纖維素的變化

注：除干物質損失率以外，其他指標的單位均基于總固體計。同列中不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。

Note: Others index is based on the total solid expect for dry matter loss rate. The different superscript letter in a same column differ significantly (<0.05).

研究表明秸稈經過濕貯存后可一定程度降解半纖維素或纖維素[22-24]。與僅補充可溶性碳源相比，補充蛋白氮源可進一步促進濕貯存過程中秸稈的半纖維素降解。劉占英研究發現，蛋白氮對纖維素降解菌具有促進作用[25]。近年也有文獻表明，秸稈自身附著著可以降解纖維素或半纖維素的微生物[26]。同時，半纖維素因其化學結構，較纖維素更易降解[27]。通過添加蛋白氮源調節秸稈C/N比，可能促進了某些可以降解半纖維素或纖維素的細菌活性。

2.3 濕貯存后各組的細菌多樣性及差異性分析

濕貯存過程實質是一系列微生物活動的過程，主要以細菌為主。選取未貯存的原料與濕貯存后的樣品進行細菌多樣性及差異性分析。如表4所示，通過各種指數綜合分析微生物群落豐度和多樣性。各組測序覆蓋深度（coverage指數用以指各樣本文庫的覆蓋率）均達到0.99，證明本次試驗的測序結果可以代表樣本的真實情況。Sob指數表示物種豐富度及OTU的實際觀測值，此處的豐富度是指群落中所含物種的多少，可得本次測序各組OTU數由大到?。篠 > R > S+SM1 > S+SM2 > S+SM3 > CK。Chao指數是反映群落豐富度的指數，Chao指數越大，表明群落的豐富度越高[28]。Chao指數由高到低：S > S+SM1 > R > S+SM3 > S+SM2 > CK。Shannon指數綜合反映了群落的豐富度與均勻度，Shannon越大，表明群落的多樣性越高[29]。Shannon指數由高到低：R > S > S-SM1 > CK > S+SM2 > S+SM3。以上結果表明，與S組相比，通過添加豆粕有效了降低濕貯存后秸稈的細菌群落多樣性。

表4 原料與濕貯存后各組的細菌群落多樣性分析指數

注：R為未貯存的原料。

Note: R is raw material.

由圖2a可知，干黃玉米秸稈原料（Raw material）主要附著變形菌門（）、放線菌門（）和擬桿菌門（），相對豐度分別為48.15%、17.83%和24.53%，少量厚壁菌門（）和螺旋體菌門（），相對豐度分別為6.37%和2.45%。濕貯存60 d后，CK組、S組、S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組的厚壁菌門（）相對豐度升高，成為優勢菌群。變形菌門（）、擬桿菌門（）和螺旋體菌門（）相對豐度降低，這與之前的研究結果一致。

由圖2b可知，干黃玉米秸稈原料（Raw material）主要附著鞘氨醇桿菌屬（）、短波單胞菌屬（）、假黃色單胞菌屬（）、短狀桿菌屬（）和單胞菌屬（）等，相對豐度分別為20.40%、7.68%、6.33%、5.20%和4.97%。少量乳酸菌，如乳桿菌屬（）、魏斯氏菌屬（）和腸球菌屬（）等，相對豐度不足1%。各處理組經過濕貯存60 d后。CK組主要以魏斯氏菌屬（）、腸球菌屬（）、片球菌屬（）、芽孢桿菌屬（）和諾卡氏菌屬（）為優勢菌群。豐度分別為15.40%、10.30%、7.22%、8.99%和5.57%。梭菌屬（）的相對豐度為3.27%。S組主要是以乳桿菌屬（）、腸球菌屬（）、片球菌屬（）、芽孢桿菌屬（）和腸桿菌屬為優勢菌群，豐度分別為11.41%、8.94%、6.80%、11.90%和5.26%。梭菌屬（）的相對豐度為0.82%。S-SM1組主要是以乳桿菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、腸球菌屬（）、芽孢桿菌屬（）和腸桿菌屬（）為優勢菌群，相對豐度分別為11.72%、9.87%、12.12%、9.48%和9.27%。梭菌屬（）的相對豐度為0。S-SM2組主要是以乳桿菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、腸球菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、腸桿菌屬（）為優勢菌群，相對豐度分別為5.76%、21.50%、16.12%、8.76%和9.90%。梭菌屬（）的相對豐度為0。S-SM3組主要是以乳桿菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、腸球菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、腸桿菌屬（）和纖維菌屬（）為優勢菌群，相對豐度分別為17.14%、19.27%、11.83%、5.17%、7.75%和5.88%。梭菌屬（）的相對豐度為0%。與S組相比，S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組分別提高了乳酸菌（乳桿菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、腸球菌屬（）和片球菌屬（））的相對豐度13%、45%和63%，梭菌屬（）相對豐度降至0，這與乳酸、丁酸產量結果一致（如圖1b和圖1e）。

圖2 原料與濕貯存后各組在門水平和屬水平的細菌群落

采用LEfSe（LDA effect Size）法分析濕貯存后各處理組的微生物組（OTU）差異效應[30]。由圖3可知，CK組（紅色）的差異物種多是對貯存不利的微生物，如好氧型細菌（糖單胞菌屬、諾卡氏菌屬）和腐敗菌（梭菌屬）。S組（淺藍）的差異物種多以兼性厭氧芽孢桿菌為主，如芽孢菌屬（）、土地芽孢桿菌屬（）、類芽孢桿菌屬（）。芽孢桿菌的產乳酸效率不及乳酸菌，一般也是期望被抑制的細菌[21]。S-SM1（綠色）的差異物種較少。S-SM2（深藍）與S-SM3（紫色）的差異物種以對貯存有利的功能菌群為主，如乳酸菌，其中S-SM2組的乳酸菌是腸球菌屬（）和魏斯氏菌屬（）；S-SM3組的乳酸菌是乳酸桿菌屬（）。一般來說，桿菌比球菌更耐酸，更適合在pH值較低的環境下生長[7]，更有利濕貯存過程中產酸，提高貯存穩定性。同時，S-SM2組與S-SM3組的差異物種分別還有假單胞菌屬（）與纖維素菌屬（），據報道這2種菌屬均具有降解木質纖維素的能力[31-34]。這可能是S-SM2組與S-SM3組半纖維素含量顯著低于其他組的原因。

注：無顯著差異的物種統一著色為黃色，差異物種跟隨組別進行著色。例如紅色節點表示CK組的差異物種。由內至外輻射的圓圈代表由門至種的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類。小寫字母表示屬水平下的差異物種。

乳酸菌是秸稈濕貯存過程中最重要的有益微生物，因其可以快速消耗可溶性碳水化合物產生乳酸或乙酸，降低pH值抑制其他微生物生長，以達到保存有機質的目的[7]。梭菌被認為是濕貯存過程中不受歡迎的腐敗菌之一[19]，它不僅會發酵糖類、蛋白質產生CO2、H2和NH3等氣體，造成能量損失，而且還會發酵乳酸生成丁酸，導致pH值回升，不利于濕貯存穩定性。與S組相比，通過添加蛋白氮源調節秸稈的C/N比后，促進了濕貯存過程中有益菌生長，抑制了腐敗菌生長。

2.4 濕貯存前后各組的產甲烷潛力及動力學分析

濕貯存前，各組累積甲烷產量如圖4a所示，CK組、S組、S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組測定結果分別為（250±0）、（269±6）、（278±4）、（292±3）和（314±2）mL/g（以VS計）。濕貯存后，各組累積甲烷產量如圖4b所示，CK組、S組、S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組測定結果分別為（263±2）、（279±9）、（289±7）、（310±8）和（348±10）mL/g（以VS計）。與貯存前相比，CK組、S組、S-SM1組、S-SM2組和S-SM3組分別提高了5.2%、3.7%、3.9%、6.1%和10.8%。與S組相比，通過添加蛋白氮源調節秸稈的C/N比后，進一步提高了濕貯存后累積甲烷產量。

注：累積甲烷產氣量的單位基于揮發性固體計。

采用修正Gompertz 方程對濕貯存前后各處理組厭氧消化過程進行擬合分析，其中延滯期()是反映厭氧消化效率的重要指標[35]，結果如表5所示。所有組決定系數2均在0.98以上，表明方程對該試驗的厭氧消化過程有較好的擬合。貯存前的各組延滯期在0.856～1.558之間，貯存后的各組延滯期在0.390～0.770。與S相比，通過添加蛋白氮源調節秸稈的C/N比后，可有效縮短延滯期，有利于提高實際沼氣工程的產甲烷效率和綜合效益。

表5 修正Gompertz方程預測濕貯存前后各組厭氧消化過程的產甲烷動力學參數

注：max、累積甲烷產量的預測值與測定值的單位基于揮發性固體計。

Note:max, predictive value and measured value of cumulative methane yield is based on the volatile solid.

干黃玉米秸稈經過濕貯存后，提高了累積甲烷產量，這與Herrmann等研究結果一致[36]。其中S-SM3組貯存后累積甲烷產量提高幅度最大。Zhao等研究結果表明，濕貯存技術提高秸稈甲烷產量與木質纖維素降解有關[22]，通過表3可知，S-SM3組的半纖維素含量顯著低于其他處理組（<0.05）。同時，Croce等研究結果表明秸稈原料的碳氮比會影響甲烷產量[11]。Weiland等研究表明秸稈原料碳氮比為20∶1，更有利于厭氧發酵過程[37]。Deubleun等研究表明秸稈原料碳氮比為20～16∶1時，可以有效提高甲烷產量[38]。這與本試驗研究結果類似。

3 結 論

1）通過可溶性碳源和蛋白氮源調節干黃玉米秸稈C/N比后，提高了濕貯存過程中乳酸、乙酸產量，降低了丁酸產量，有效提高原料的貯存品質；促進了濕貯存過程中有益菌（乳酸菌）活性，抑制了腐敗菌（梭菌）生長，改善了原料的貯存穩定性；降低了濕貯存后干黃玉米秸稈的半纖維素含量，提高了原料的生物可降解性。

2）調節干黃玉米秸稈初始C/N比為30～20∶1，經過濕貯存后，提高了原料的累積甲烷產量，并有效降低厭氧發酵過程的延滯期，有利于提高秸稈沼氣工程的產甲烷效率。

3）綜上所述，以干黃秸稈為沼氣工程原料時，以補充添加劑的方式調節原料初始C/N后，不僅可以改善濕貯存品質，還可以有效提高原料濕貯存后的產甲烷潛力。在實際工程應用中，為降低工程運行成本，在原料可溶性碳源充足的前提下，建議結合當地實際情況，可以適當補充其他含氮高的廢棄物進行混合貯存，如酒糟、豆腐渣等。

[1]Sun H, Cui X, Stinner W, et al. Synergetic effect of combined ensiling of freshly harvested and excessively wilted maize stover for efficient biogas production[J]. Bioresource Technology, 2019, 285(8),121338.

[2]Kalac P. The required characteristics of ensiled crops used as a feedstock for biogas production: A review[J]. Journal of Agrobiology. 2001, 28(2): 85－96.

[3]Franco R T, Buffiere P, Bayard R. Optimizing storage of a catch crop before biogas production: Impact of ensiling and wilting under unsuitable weather conditions[J]. Biomass and Bioenergy, 2017, 100: 84－91.

[4]Franco R T, Buffiere P, Bayard R. Ensiling for biogas production: Critical parameters. A review[J]. Biomass and Bioenergy, 2016, 94: 94－104.

[5]Shinners K J, Wepner A D, Muck R E, et al. Aerobic and anaerobic storage of single-pass, chopped corn straw[J]. Bioenergy Research, 2011, 4(1): 61－75.

[6]Guo J B, Cui X, Sun H, et al. Effect of glucose and cellulase addition on wet-storage of excessively wilted maize stover and biogas production[J]. Bioresource Technology. 2018, 259: 198－206.

[7]McDonald P, Henderson A R, Heron S J E. The biochemistry of silage[M]. England: Chalcombe Publications, 1991.

[8]Yong Z H, Dong Y L, Zhang X, et al. Anaerobic co-digestion of food waste and straw for biogas production[J]. Renewable Energy, 2015, 78: 527－530.

[9]Li X, Liu Y H, Zhang X, et al. Evaluation of biogas production performance and dynamics of the microbial community in different straws[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016, 27(3): 524.

[10]Chandra R, Takeuchi H, Hasegawa T. Methane production from lignocellulosic agricultural crop wastes: A review in context to second generation of biofuel production[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2012, 16(3): 1462－1476.

[11]Croce S, Wei Q, D"imporzano G, et al. Anaerobic digestion of straw and corn stover: The effect of biological process optimization and pre-treatment on total bio-methane yield and energy performance[J]. Biotechnology Advances, 2016, 34: 1289－1304.

[12]Liu S, Ge X M, Liew L N, et al. Effect of urea addition on giant reed ensilage and subsequent methane production by anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology, 2015, 192: 682－688.

[13]馬茹霞，趙一全，李家威，等. 玉米秸稈厭氧發酵過程中的氮源優化[J]. 可再生能源，2018，36(11)：17－23.

Ma Ruxia, Zhao Yiquan, Li Jiawei, et al. The optimization of nitrogen sources in anaerobic digestion of corn stover[J]. Renewable Energy Resources, 2018, 36(11): 17－23. (in Chinese with English abstract)

[14]Motte J C, Escudie R, Bernet N, et al. Dynamic effect of total solid content, low substrate/inoculum ratio and particle size on solid-state anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology, 2013, 144(3): 141－148.

[15]張亞麗，徐忠. 脫脂豆粕蛋白對乳酸菌增殖作用的研究[J]. 哈爾濱商業大學學報：自然科學版，2003，19(1)：87－89.

Zhang Yali, Xu Zhong. Study on proliferation of lactic acid bacteria with adding SPH[J]. Journal of Heilongjiang Commercial College: Natural Sciences Edition, 2003, 19(1): 87－89. (in Chinese with English abstract)

[16]劉晶晶. 生物添加劑對柳枝稷青貯的作用及機理研究[D]. 北京：中國農業大學，2015.

Liu Jingjing. Effect of Lactic Acid Bacteria and Fibrolytic Enzymes on the Fermentation Quality of Switchgrass Silage and Mechanism Involved[D]. Beijing: China Agricultural University, 2015. (in Chinese with English abstract)

[17]柳珊. 不同生物預處理對蘆竹和玉米秸稈及其厭氧消化性能影響研究[D]. 北京：中國農業大學，2015.

Liu Shan. Effect of Biological Pretreatments on Anaerobic Digestion of Giant Reed and Corn stover[D]. Beijing: China Agricultural University, 2015. (in Chinese with English abstract)

[18]Kreuger E, Nges I A, Bjornsson L. Ensiling of crops for biogas production: Effects on methane yield and total solids determination[J]. Biotechnology for Biofuels, 2011, 4(1): 1－8.

[19]徐春城. 現代青貯理論與技術[M]. 北京：科學出版社，2013.

[20]Buxton D R, Muck R E, Harrison J H, Silage science and technology[M]. USA: Soil Science Society of America, 2003.

[21]崔憲，郭建斌，徐艷，等. 秸稈濕貯存過程添加劑協同調控對甲烷產量的影響[J]. 農業機械學報，2018，49(9)：302－310.

Cui Xian, Guo Jianbin, Xu Yan, et al. Effect of wet-storage additives on fermentation performance and biomethane potential of corn stover[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2018, 49(9): 302－310. (in Chinese with English abstract)

[22]Zhao X L, Liu J H, Liu J J, et al.Effect of ensiling and silage additives on biogas production and microbial community dynamics during anaerobic digestion of switchgrass[J]. Bioresource Technology, 2017, 241: 349－359.

[23]Zhao Y B, Yu J D, Liu J J, et al. Material and microbial changes during corn stalk silage and their effects on methane fermentation[J]. Bioresource Technology, 2016, 222: 89－99.

[24]Menardo P S, Balsari E, Tabacco G, et al. Effect of conservation time and the addition of lactic acid bacteria on the biogas and methane production of corn stalk silage[J]. Bioenergy Research, 2015, 8(4):1810－1823.

[25]劉占英. 綿羊瘤胃主要纖維降解細菌的分離鑒定及不同氮源對其纖維降解能力的影響[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2008.

Liu Zhanying. Isolation and Identification of Major Cellulolytic Bacteria in Rumen of Sheep and Effects of Nitrogen Sources on Their Cellulolytic Activities[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2008. (in Chinese with English abstract)

[26]Ning T T, Wang H L, Zheng M L, et al. Effects of microbial enzymes on starch and hemicellulose degradation in total mixed ration silages[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2017, 30(2): 171－180.

[27]Hendriks A T W M, Zeeman G. Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(1): 10－18.

[28]Chao A. Nonparametric estimation of the number of classes in a population[J]. Scandinavian Journal of Statistics, 1984, 11(4): 265－270.

[29]溫嘯宇. 氮源添加對干黃玉米秸稈濕貯存過程及產甲烷性能的影響[D]. 北京：中國農業大學，2018.

Wen Xiaoyu. Effect of Nitrogenous Additives on the Wet Storage Period and Methane Production of Excessively Wilted Maize Stover[D]. Beijing: China Agricultural University, 2018. (in Chinese with English abstract)

[30]劉波，王階平，陳倩倩，等. 養豬發酵床微生物宏基因組基本分析方法[J]. 福建農業學報，2016，31(6)：630－648.

Liu Bo, Wang Jieping, Chen Qianqian, et al. Metagenomic analysis of microbial community in microbial fermentation-bed for pig raising[J]. Fujian Journal of Agricultural Science, 2016, 31(6): 630－648. (in Chinese with English abstract)

[31]Dou T Y, Chen J, Hao Y F, et al. Effects of different carbon sources on enzyme production and ultrastructure of[J]. Current Microbiology, 2019, 76(6): 1－6.

[32]Song J M, Wei D Z. Production and characterization of cellulases and xylanases ofgrown in pretreated and extracted bagasse and minimal nutrient medium M9[J]. Biomass and Bioenergy, 2010, 34(12): 1930－1934.

[33]方華舟，王培清. 牛糞堆肥各階段主要纖維素降解菌分離與作用規律分析[J]. 中國土壤與肥料，2012(6)：88－92.

Fang Huazhou, Wang Peiqing. Cellulose degradation bacteria separation and action rule analysis of cow dung compost in various stages[J]. Soil and Fertilizer Science in China, 2012(6): 88－92. (in Chinese with English abstract)

[34]陶蓮，刁其玉. 青貯發酵對玉米秸稈品質及菌群構成的影響[J]. 動物營養學報，2016，28(1)：198－207.

Tao Lian, Diao Qiyu. Effects of ensiling on quality and bacteria composition of corn stalk[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition，2016, 28(1): 198－207. (in Chinese with English abstract)

[35]崔憲，郭建斌，溫嘯宇，等. 濕貯存對玉米秸稈厭氧消化性能的影響[J]. 中國沼氣，2018，36(3)：27－32.

Cui Xian, Guo Jianbin, Wen Xiaoyu, et al. Effect of wet-storage of corn straw on its anaerobic fermentation[J]. China Biogas, 2018, 36(3): 27－32. (in Chinese English abstract)

[36]Herrmann C, Heiermann M, Idler C. Effects of ensiling, silage additives and storage period on methane formation of biogas crops[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(8): 5153－5161.

[37]Weiland P. Biogas production: Current state and perspectives[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85(4): 849－860.

[38]Deubleun D, Steinhauser A. Biogas from Waste and Renewable Resources: An Introduction[M]. USA: Wiley, 2010.

Effects of C/N ratio of wilted maize straw on wet storage process and subsequent methane production

Cui Xian1, Zhang Leping1, Sun Hui1, Wen Xiaoyu1,2, Guo Jianbin1※, Dong Renjie1,3

(1.,,100083,; 2,,100091,; 3.,,264670,)

In northern China, large amounts of wilted maize straw as agricultural waste are produced annually due to the cropping system, harvesting method and so on. Straw-biogas-fertilizer has become one of the promoted utilization modes in major grain-maize producing areas of northern China. Straw is anaerobically digested to produce methane while digestate (effluent of anaerobic digestion process) is utilized as organic fertilizer. Wet storage is always reported as a preferred strategy to preserve energy crops for methane production. It can control microbial activity by a combination of an anaerobic environment and a natural fermentation of sugars by lactic acid bacteria on the crop to achieve lower dry matter loss compared to hay or open-air storage. However, the C/N ratio of wilted maize straw is generally 100-60:1, not only affects the microbial activity during storage, but also is not conducive to the anaerobic digestion. In this study, the effects of adjusting the C/N ratio of wilted maize straw by adding sucrose and soybean meal on the storage quality and subsequent methane production were studied. Wilted maize straw has been stored for 60 days with five treatments, including CK group (without additives), S group (only sucrose and water were added where the water-soluble carbon content and moisture content were adjusted to 3.5% and 65%, respectively), S-SM1 group (sucrose, soybean meal and water were added where, the water-soluble carbon content, C/N ratio and moisture content were adjusted to 3.5%, 30:1 and 65%, respectively), S-SM2 group (sucrose, soybean meal and water was added where the water-soluble carbon content, C/N ratio and moisture content were adjusted to 3.5%, 25:1 and 65%, respectively), S-SM3 group (sucrose, soybean meal and water were added where the water-soluble carbon content, C/N ratio and moisture content were adjusted to 3.5%, 20:1 and 65%, respectively). The results of 60-day wet storage experiment showed that, when the C/N ratio of wilted maize straw was adjusted to 30:1, 25:1 and 20:1, there was no significant effect (0.05) on pH value and dry matter loss but decreased the hemicellulose content compared to S group. At the same time, the lactic acid content was increased by 19.0%, 22.2% and 31.7%, respectively. The acetic acid content was increased by 20.0%, 30.0% and 30.0%, respectively. The butyric acid content was decreased by 55.0%, 65.0% and 65.0%, respectively. The relative abundance of lactic acid bacteria (,,,) was increased by 13%, 45% and 63%, respectively. The relative abundance ofwas reduced to 0%. The results of LEfse analysis showed thatandbecome biomarker when the C/N ratio of wiltedcorn straw was 20:1. The results of biomethane potential test showed that, the specific methane yield of CK group, S group, S-SM1 group, S-SM2 group and S-SM3 group was increased by 5.2%, 3.7%, 3.9%, 6.1% and 10.8%, respectively, compared with treatment groups before wet storage. Simulating the anaerobic digestion performance by the modifying Gompertz equation shows that adjusting the C/N ratio of straw can reduce the lag period. In summary, by adding water-soluble carbon and protein nitrogen to adjust the C/N ratio of wilted maize straw, it can effectively improve the storage quality, biodegradability and specific methane yield of wilted corn straw. In practical engineering applications, in order to reduce the cost of the project, it is appropriate to supplement other agricultural wastes with high nitrogen content for mixed storage.

straw; fermentation; methane; wiltedmaize straw; wet-storage; anaerobic digestion; C/N ratio; lactic acid

崔 憲，張樂平，孫 輝，溫嘯宇，郭建斌，董仁杰. 碳氮比對干黃秸稈貯存及后續甲烷產量的影響[J]. 農業工程學報，2019，35(23)：250－257.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.23.031 http://www.tcsae.org

Cui Xian, Zhang Leping, Sun Hui, Wen Xiaoyu, Guo Jianbin, Dong Renjie. Effects of C/N ratio of wilted maize straw on wet storage process and subsequent methane production[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(23): 250－257. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.23.031 http://www.tcsae.org

2019-08-11

2019-11-13

國家自然科學基金青年科學基金項目（51608523）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD21B04）

崔憲，博士生，主要從事秸稈濕貯存技術及厭氧發酵研究。Email：cuixiancau@163.com

郭建斌，副教授，博士，博士生導師，主要從事廢棄物處理與資源化利用研究。Email：jianbinguo@cau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.23.031

X705; S216.4

A

1002-6819(2019)-23-0250-08