腸道微生態調節對移植物抗宿主病防治的研究進展

張晉瑄，易 海，林 寧

移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease, GVHD)是一種特異的免疫現象，是移植物組織中的免疫活性細胞與免疫受抑制的、組織不相容性抗原受者的組織之間的反應。移植物抗宿主病、感染、復發是異基因造血干細胞移植(Allogenic hematopoietic stem cell transplantation, Allo-HSCT)的主要死亡原因，其中移植物抗宿主病較常見。2016年西奈山急性GVHD研究聯盟(Mount Sinai Acute GVHD International Consortium)指南[1]將GVHD嚴重程度根據皮膚、肝臟和消化道癥狀分為五級。腸道的排異主要表現為大量腹瀉、血便和腸梗阻癥狀。

腸道作為機體最大的免疫器官在多種疾病發生發展中發揮重要作用，腸道正常定植的微生物在其中扮演重要角色。在異基因造血干細胞移植中，因腸道對自身免疫因素干擾較強，臨床上通常在移植前先行使用藥物對腸道菌群進行“清掃”，以減少腸道來源的排異反應。Jenq RR[2]的研究表明，HSCT后微生物多樣性的喪失會導致更高的死亡率，大劑量使用抗生素對腸道微生物系統產生了不良作用。在Ernst Holler[3]的研究中，良好的腸道微生物系統對患者的生存率和結局都是有益的，在同樣使用抗生素的前提下，正常的腸道微生物群可以重構患者腸內免疫屏障，不但讓患者得以在癥狀上緩解，而且從長遠的角度來看增加患者的生存質量，提高患者的生存率，對患者的積極作用遠大于消極作用。由此可見，腸道的微生態在異基因造血干細胞移植中扮演重要角色，但是其在GVHD中的作用和使用方法未見系統報道。

1 益生元在GVHD中的作用

1.1 益生元的概念與種類 益生元(prebiosis)是指需要經由腸道微生物代謝后轉化為可被腸上皮細胞(intestinal epithelial cell, IEC)利用的營養物，從而改善整體健康的難消化碳水化合物[4]。在2004年益生元的定義更新為“一種選擇性發酵成分，可以特定改變胃腸道微生物群落的組成和/或活性，從而賦予宿主健康益處”[5]。2007年，糧農組織與世界衛生組織描述益生元為“一種可以賦予宿主健康的，與調控微生物有關的無活力的食物成分”[6]。益生元在腸道內通常由不同長度的糖鏈組合成難以消化的寡糖和多糖(體外研究顯示最令人滿意的一般為低聚糖)，在腸道微生物作用下分解為短鏈脂肪酸提供能量并改善腸道免疫力。已知的通常益生元僅限于多糖菊粉及其衍生物與低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、異麥芽低聚糖(IMO)等[7-8]。

1.2 益生元對GVHD結局的影響 Satoshi Iyama等人[9]進行了谷氨酰胺、纖維素和果寡糖(GFO)對于異體移植患者的回顧性隊列研究，主要探討了其有效性和安全性。其中22名受試者接受了谷氨酰胺、纖維素和果寡糖，自起始治療前7天開始，每日三次口服益生元粉(每包GFO含3g谷氨酰胺、5g膳食纖維、1.5g低聚糖及1.2mg鈉)，至治療后28天截止，若出現嚴重排異者則停止給藥。相較回顧同期未接受治療患者22名而言，在性別、年齡、ECOG體力評分狀態、基礎診斷、疾病狀態、調理方案、GVHD預防、與移植物來源無顯著差異的情況下，干預組補充使用GFO與中度腹瀉(2級，P=0.0001)，嚴重腹瀉(3-4級，P=0.001)和嚴重粘膜炎(3-4級，P=0.033)明顯的患病天數減少顯著相關，接受補充劑的患者與未接受補充劑的患者的生存率存在顯著差異(分別為100%和77%，P=0.0091)。該研究的局限在于是回顧性分析，且樣本量較小。

2 益生菌在GVHD中的作用

2.1 益生菌的概念與種類 2002年聯合國糧食農業組織與世界衛生組織將益生菌定義為“經過嚴格挑選的微生物‘活菌株’，足量使用時，可以對宿主健康提供益處”[10]，此定義在2013年由國際益生菌和益生元科學協會再次確認[11]。人類常用的益生菌一般包含以下種類：乳桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌、鏈球菌、腸球菌，此外還包含一些屬于芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性菌菌株和屬于酵母菌屬的酵母菌株[12]。益生菌主要可以對生物體內的微生物群發育產生影響，維持與病原體之間的平衡和生物體的正常功能。此外，其在功能性食品的生產、食品的保存、抗生素使用后天然微生物群的恢復、抵抗污染食物與環境中病原微生物群的等活動中也有不可或缺的作用。益生菌主要通過菌株共聚集能力，形成保護屏障，防止病原菌定植。益生菌附著在宿主腸道上皮細胞激活了導致免疫調節相關的信號傳導通路，對免疫調節產生一定影響，并產生小分子量物質(如過氧化氫物與短鏈脂肪酸)抑制病原體復制作用[13-14]。

2.2 益生菌對GVHD的作用 益生菌(probiosis)因在腸道免疫調節方面十分重要，因此也被臨床上廣泛使用。EJ Ladas等人[15]在2010年1月至2014年6月間隨機選取30名接受移植的兒童，通過口服或管飼方式給予特殊益生菌(植物乳桿菌，LBP(1*10^8菌落形成單位/kg/天)。結果顯示，于觀察期內(100天)接受益生菌移植后的死亡受試者中無一人存在GVHD的診斷，但在100天后有9名患者被診斷為GVHD(其中5名患者被診斷為2 級，4名患者被診斷為3級)。與此同時有7名患者(23%)出現急性胃腸道GVHD癥狀,其中3名患者診斷為1級胃腸道急性移植物抗宿主病(gastrointestinal acute graft-versus-host disease，GI aGVHD)，有4名患者診斷為3級GI aGVHD，沒有患者到達4級GI aGVHD的診斷。在文章的最后作者指出,盡管在試驗中給予植物乳桿菌并未形成單獨的致病菌落，但是通過口服方式給藥仍不是推薦途徑。Elan Gorshein等人[16]將31名異基因干細胞移植術后患者分成2組，其中20名患者給予口服膠囊形式補充活鼠李乳桿菌特定益生菌GG(由Culturelle提供的100億活鼠李糖乳桿菌GG的膠囊)，另11人給予常規治療，分別于第3個月、第6個月及第12個月末記錄患者癥狀與結局。研究發現益生菌GG提高了腸道微生態的多樣性和豐富度，但和對照組相比沒有顯著差異，相對于GVHD的癥狀改善也并未體現出明顯優勢。在動物實驗也存在相似的結論。AnaC T Mercadante等[17]人對8-14周齡的小鼠通過口服喂養益生菌聯合B細胞誘導，觀察動物體重減輕、皮毛質地、活動、姿勢、糞便稠度及存活率指標，實驗組GVHD發生率較對照組(未干預)降低，并在移植后21天進行組織器官病理學評分，發現實驗組脾臟肝臟消化道等器官受損程度較低。

3 合生元在GVHD中的作用

合生元(synbiosis)一般是將益生元與益生菌進行混合，使其在功能和作用上達到相互協同的作用，繼而進一步改善腸道微生態或調節免疫功能。合生元還能刺激特定腸道天然細菌菌株(乳酸桿菌、雙歧桿菌等)的增殖[18]。合生元在體內通過益生元刺激益生菌調節腸道內的代謝活動，維持正常微生物結構，發展有益的微生物群，抑制胃腸道中存在的潛在病原體[19]。在合生元中，低聚糖與雙歧桿菌屬或乳桿菌屬細菌最為常見，常被用于有胃腸道反應的患者中。目前對于合生元在GVHD中使用的人群研究未見報道，同樣在動物實驗中亦未見報道。但根據Fozia Noor等人[20]在2018年的文章中所述，當前兩項研究(抗性淀粉與益生菌對GVHD的抵抗作用)正在進行，故尚未有結果發表。

4 糞菌移植對GVHD的作用

4.1 糞菌移植的概念與功能 糞菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)是指其將健康人糞便中的功能菌群，移植到患者胃腸道內，重建新的腸道菌群，實現腸道及腸道外疾病的治療。糞菌移植屬于微生態系統治療的手段之一，而這種手段在2013年就得以應用于C difficile感染的2名患者的治療中[21]。FMT可以通過免疫介導的途徑調節腸粘膜屏障功能的修復，通過天然微生物群連續信號轉導維持優勢結構和功能，增強自身免疫抵抗病原體[22]。腸粘膜的上皮細胞群(如腸細胞、杯狀細胞、潘氏細胞、腸道干細胞等)會受到預處理方案(激素使用等)和急性GVHD的聯合作用或二者對其的單獨影響[23]。此外，FMT可調節性T細胞與先天性淋巴細胞(ILCs)產生的Th17類細胞因子，增加白介素22(IL-22)在腸道內的含量。ILCs是受損組織恢復與再生的重要組成部分，但是其作用可能受到持續性損傷的限制[24]。GVHD引起的ILCs損傷可能導致信號丟失，但是白介素22可以限制GVHD所引起的腸道病變的嚴重程度而發揮保護作用[25]。FMT可以為GVHD提供必要的強直信號促進上皮再生、黏蛋白與抗微生物肽的產生，其對免疫和上皮細胞的有益作用可以減輕GVHD的嚴重程度[26-27]。

4.2 糞菌移植對GVHD的作用 Webb B J[28]等人在2016年主要針對艱難梭菌感染問題做了相關性研究，由于艱難梭菌感染與GVHD的關聯程度較高，故將其作為GVHD的相關性指標之一。其團隊在2015年2月至2016年2月對7名異基因干細胞移植術后患者分別進行8次糞菌移植，其中5名患者通過鼻-空腸管給藥，一名患者接受結腸鏡給藥，1名患者同時接受兩種方式。5名患者接受預防性使用免疫抑制劑，2名患者已出現腸道GVHD反應。在試驗過程中，沒有發現重大不良事件，全因死亡率為0%，只有一名患者糞菌移植術后10天出現腹痛且自行緩解，臨床懷疑為小腸細菌過度生長。就給藥方式而言，通過鼻-空腸管途徑給藥具有良好的耐受性，降低了由于鼻胃管滴注的可能引起的誤吸風險并提高了患者的滿意度。該方法比結腸鏡給藥便宜，并且不會使患者暴露于清醒鎮靜或腸內吹氣的風險中。Kazuhiko Kakihana[29]同年發表的研究顯示，對4名急性髓系白血病GVHD患者(3名患者被診斷為遲發型急性GVHD)通過鼻-十二指腸管給藥途徑分別于異基因干細胞移植給予甲潑尼龍后(第一階段)和收集糞便后(第二階段，中位數6小時)兩次給予FMT，對不同患者根據移植類型、癥狀程度等予以1mg/kg或2mg/kg劑量，移植后對糞便進行檢測，并對癥狀進行綜合評價。結果表明FMT的治療有效(其中3名患者完全緩解，1名部分緩解)，且在激素抵抗病例中數天內觀察到胃腸道癥狀的改善。此外，在3名患者中，激素劑量比FMT之前減少一半以上(平均減少69%)，表明FMT可能通過改變腸道微生態將全身同種異體免疫反應轉變為抗炎狀態，并可能對其他急性GVHD有效。Zachariah DeFilipp等人[30]對13名患者進行FMT，其中2名患者發生3-4級的胃腸道GVHD，1名患者在糞菌移植20天后不但有嚴重胃腸道GVHD并伴隨有細菌感染和多臟器功能衰竭。在隨訪過程中共6名患者被診斷為中重度慢性GVHD。Xiaofei Qi等[31]人對8名患有激素抵抗胃腸道GVHD患者進行FMT的初步研究中，2名患者由于出現并發癥放棄治療很快死亡，1名患者死于腦出血，1名患者在糞菌移植后第9天因經濟問題放棄治療死亡。總體觀察來說，患者在通過糞菌移植后腹痛腹瀉癥狀很快緩解，糞便量和次數減少，甚至在第一次FMT后的2周隨訪中，2名患者的腹瀉和所有其他5名患者的腹痛癥狀消失。該研究另外回顧了8名常規治療患者資料作為對照，在90天隨訪時間中，盡管FMT組患者癥狀有所改善，但兩組之間死亡率并沒有顯著差異。綜上所述，糞菌移植可作為GVHD的治療選擇，但是其有效性仍需進一步探究。

5 展 望

隨著生物技術的不斷發展，GVHD得到了越來越多的重視。腸道微生態調節在GVHD治療中尚有很多未知的領域亟需探索。綜上所述，益生元、益生菌與糞菌移植都存在小樣本量的人群研究，盡管研究結果均不同程度提示調節腸道微生態對于GVHD癥狀或治療結局的可能改善作用，但是缺乏嚴謹設計的隨機對照研究。其菌株使用的時機、種類、濃度等也是目前研究沒有回答的問題，尚需要基礎和臨床研究加以驗證。